沉默SMAD4降低MIA PaCa-2细胞对吉西他滨的敏感性

安倩 曹雪婷 吴博雅 陈静

摘要：目的探究SMAD4基因缺失后对胰腺癌MIA PaCa-2细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。方法应用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测SMAD4基因的mRNA和蛋白水平的表达。CCK8方法检测不同浓度吉西他滨对MIA PaCa-2细胞的毒性作用，进而选取最佳作用浓度。同时，台盼蓝实验检测吉西他滨在不同时间作用下对MIA PaCa-2细胞存活率的影响，进而选取最佳作用时间。最后，通过Transwell实验检测基因沉默与药物共同作用下对细胞迁移和侵袭的影响。结果吉西他滨作用MIA PaCa-2细胞最佳浓度为10-7 M、最佳时间是48 h。与对照组相比，敲除SMAD4基因后吉西他滨作用的MIA PaCa-2细胞的存活率有所上升，且通过小室的转染组细胞数明显高于无转染组细胞数。结论吉西他滨能抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭，且SMAD4基因敲除后使胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力明显增加，以及敲除后能部分抑制吉西他滨对胰腺癌细胞的杀伤作用。

关键词：SMAD4;胰腺癌;吉西他滨

【中图分类号】 F763 【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）10--02

胰腺癌（PC）是当前恶性程度相当高并迅速致命的难治性胃肠道癌症之一，其发病率在世界范围内也呈现出增加的态势，但在我国患者中出现时多数已是为晚期，死亡率几乎100%。最新的检测结果、流行病学和最终结论估计，在胰腺癌所有阶段的总体五年生存率仅为10%（2010-2016年）[1]。自1997年，吉西他滨（GEM）首次被证实其对胰腺癌的化疗效果较之以前一直应用的氟尿嘧啶有优越性以来，在针对胰腺癌的化疗中，无论是单独应用或联合应用，吉西他病一直作为一线首选用药[2]。

SMAD4基因最初是基于胰腺肿瘤中频繁的18q21.1纯合缺失和突变而被发现的，并被发现参与了TGF-β的信号通路。SMAD4基因在多种恶性肿瘤种类中缺失或突变，如胰腺癌、结肠癌、食管癌、胃癌和肝癌，特别是消化系统肿瘤。因此，它被认为是一种肿瘤抑制基因[3]。目前的文献中对于SMAD4的缺失是否与胰腺癌的对吉西他滨的敏感性相关，缺乏一定的数据支持和研究。所以，本研究旨在探讨SMAD4基因缺失后吉西他滨对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1材料与方法

1.1细胞培养

胰腺癌细胞株MIA PaCa-2细胞（购自武汉普诺赛生命科技有限公司）。用含10%胎牛血清（Gibco），37℃、5%CO2培养箱中培养。当融合度达到80～90%时，用0.25%胰酶消化传代。

1.2 CCK8实验

本研究使用CCK8法测定抑制率。细胞接种于96孔板（8000个细胞/孔），每孔100μL，培养24 h后，分别加入含有10-11 M～10-3 M的GEM的无血清培养基，37℃、5%CO2培养箱培养48 h，在450 nm波长测定OD值。并计算IC50值（50%抑制浓度，也称半抑制浓度），从而选出最佳浓度。

1.3台盼蓝排斥实验

使用台盼蓝排斥实验筛选出最佳作用时间。细胞以20×105個/孔均匀铺在六孔板中，在37℃、5%CO2培养24 h后，加入10-7 M的GEM无血清培养基，每个药物浓度设3个复孔。继续培养24 h、48 h、72 h后，制成50 uL的细胞悬液，加入50 uL 0.5%台盼蓝染液，染色3 min，再用倒置显微镜下观察细胞着色情况，将死细胞染成蓝色，活细胞不染色，计算不同时间的存活率。

1.4细胞转染

SMAD4基因的siRNA（阴性对照、、阳性对照、三组siRNA）从吉玛基因购买。引物序列分别为：

阴性对照（F：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，

R：5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3），

2140（F：5-GCUCCUAGACGAAGUACUUTT-3，R：5-AAGUACUUCGUCUAGGAGCTT-3）、

1045（F：5-GCCAUCGUUGUCCACUGAATT-3，R：5-UUCAGUGGACAACGAUGGCTT-3）、

1306（F：5-GCCAGCUACUUACCAUCAUTT-3，R：5-AUGAUGGUAAGUAGCUGGCTT-3）。

将MIA PaCa-2细胞接种于6孔板（5.0x105个/孔）中24 h后，使第二天细胞密度高达到70%～90%。MIA PaCa-2细胞转染前24 h分为两组：i）阴性对照亚组、1306亚组、2140亚组、1045亚组;ii）阴性对照（0.1%PBS）亚组、阴性对照+GEM（10-7M）亚组、si-SMAD4亚组、si-SMAD4+GEM（10-7M）亚组。每组设置三个复孔。HighGene转染试剂（ABclonal）瞬时转染。转染24 h后，进行qPCR实验，转染48 h后，进行Western blot实验。

1.5实时荧光定量PCR（qPCR）分析

用成都福际RNA提取试剂盒（RE-03012）在细胞中分离总RNA。使用庄盟公司提供的第一链反转录试剂盒（ZR102-1），得到cDNA。使用以下参数在ABI PRISM 7500FAST PCR序列检测系统上进行qPCR测定：95℃3min，95℃5s，60℃34s，共40个循环。靶基因倍数变化用2-ΔΔCt法计算。用于qPCR的引物如下：

SMAD4（F：5-CTCCCATCCAATGTTCTCTGTA-3，

R：5-ACAAGTAATGATGCCTGTCTGA-3;

GAPDH：F：5-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3，

R：5-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3。

1.6 Western blot分析

用細胞裂解液（每1 mL RIPA裂解液加入2 uL的蛋白酶抑制剂）从培养细胞中提取总蛋白。4℃下12000 rpm离心10 min。BCA蛋白定量试剂盒（美仑生物）检测蛋白浓度。用10%的SDS-PAGE分离蛋白质，并转移到PVDF膜上，再用配好的5%脱脂牛奶封闭2 h，使用兔抗SMAD4孵育一抗（1：2，000，ThermoFisher），再移至4℃冰箱过夜。膜用TBST清洗3次。然后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（1：10，000;ABclonal）作为二次抗体孵育。通过增强化学发光（ECL;Thermo Fisher Science）对斑点进行可视化。ECL系统（amersham;GE Healthcare）用于检测条带，最后用Image J软件分析。

1.7 Transwell细胞迁移和侵袭实验

24孔板下室加入600?L含20%FBS的完全培养基，取100?L细胞密度为2×105/mL的悬液加入transwell小室上室（注意：侵袭实验的小室需用50?L matrigel胶稀释液包被transwell小室底部膜的上室，37℃，1 h）。37℃，5%CO2培养24 h后加入10-7 M浓度的吉西他滨，每组设三个复孔。培养48 h后，Gimsa染色，显微镜下观察，拍照，取五个视野计算平均数。

1.8统计学分析

所有实验均独立重复3次，分析结果均以平均值±标准差显示。数据结果通过单因素方差分析、t检验完成，各数据使用SPSS 13.0统计学分析软件，并通过Graphpad prism 8.0和Image J软件处理分析。P<0.05时，具有统计学意义。

2实验结果

2.1吉西他滨对MIA PaCa-2细胞的毒性作用

CCK8法检测药物对细胞的毒性作用，以便筛选出最佳作用浓度。MIA PaCa-2细胞中加入不同浓度的GEM作用48 h后，GEM以浓度依赖性降低胰腺癌细胞的存活率。进而得出IC50为-7.07±0.38，故选择GEM作用MIA PaCa-2细胞的最佳浓度为10-7 M。同时，进行台盼蓝实验测定10-7 M浓度的GEM对MIA PaCa-2细胞在0 h、24 h、48 h、72 h的抑制作用，从而选择出最佳的作用时间。得出结果为细胞存活率分别为96.40±0.75、71.45±3.00、36.69±3.67、21.69±2.04，GEM以时间依懒性降低MIA PaCa-2细胞的存活率，根据存活率结果选取48 h为GEM作用细胞的最佳时间。

2.2敲低SMAD4基因降低吉西他滨对胰腺癌细胞的作用

2.2.1沉默SMAD4基因抑制吉西他滨对细胞的毒性作用

首先，通过吉玛基因设计了SMAD4基因的三个不重叠siRNA，被命名为：“2140”、“1045”和“1306”。qPCR和Western Blot实验分析“1306”的转染效率最高，可达到70%以上（图1）。故以下实验使用“1306”这一siRNA转染。

用10-9 M～10-5 M浓度的GEM作用细胞48 h，进行CCK8细胞毒性检测。从图2看出，转染组的细胞存活率比对照组明显上调（P<0.05），说明较高浓度的GEM和siRNA联合使用比只使用GEM对细胞杀伤作用有所减弱，进一步说明敲低SMAD4的胰腺癌细胞下调GEM的敏感性。

2.2.2转染siRNA降低吉西他滨抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭

为进一步验证SMAD4基因与GEM对胰腺癌细胞迁移侵袭的影响，用10-7 M浓度的GEM对转染和不转染siRNA的MIA PaCa-2细胞作用48 h，进行Transwell细胞迁移和侵袭实验。由表1可看出，与PBS组相比，加药组细胞迁移和侵袭的细胞数明显降低，但转染组相较于无转染组的迁移侵袭细胞数是上调的。说明GEM能抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭作用，同时转染siRNA后，GEM的抑制作用明显下调。综上所述，沉默SMAD4基因后，GEM的治疗作用受到抑制，且明显降低了GEM对胰腺癌细胞的迁移侵袭的抑制作用。

3. 讨论

胰腺癌是人类恶性癌症中高致死性的病变，它起病隐匿，发展较快，治疗效果和预后都很差，预测到2030年，居人类恶性肿瘤死亡率第二[4]。胰腺癌的致死数与发病人数都呈上升趋势，是两性癌症死亡的第七大原因素。因此，识别生物标志物对早期诊断和基因靶向治疗的发展至关重要。

SMAD4基因位于18号染色体上，由12个外显子构成，编码552个氨基酸序列。在大约30%的胰腺癌中，SMAD4纯合缺失。同时，SMAD4在胰腺导管腺癌中，约55%-60%表现出SMAD4的突变失活。核苷类似物吉西他滨通过将脱氧胞苷的20个碳原子替换为氟原子来抑制DNA复制。由于化疗耐药性的产生，它对人胰腺癌细胞的细胞毒性是有限的。GEM诱导的细胞凋亡与癌细胞中的DNA损伤有关，抑制或修复GEM诱导的DNA损伤可以显著减少癌细胞的凋亡[5]。在这项研究中，我们首先检测吉西他滨对细胞的敏感性，筛选出吉西他滨作用胰腺癌细胞的最佳作用浓度和时间。通过靶向siRNA敲除SMAD4，能够显著增强胰腺癌的恶性肿瘤进展，从而提高细胞迁移侵袭能力，并明显抑制了GEM对胰腺癌细胞的杀伤作用。

参考文献：

Siegel Rebecca L，Miller Kimberly，Fuchs Hannah E，et al.Cancer Statistics，2021[J].CA：A Cancer Journal for Clinicians，2021，71（1）.

Salewski I，Henne J，Engster L，et al.Combined Gemcitabine and Immune-Checkpoint Inhibition Conquers Anti-PD-L1 Resistance in Low-Immunogenic Mismatch Repair-Deficient Tumors[J].Mol Sci.2021 Jun 1;22（11）：5990.

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Ono H，Basson MD，Ito H.P300 inhibition enhances gemcitabine-induced apoptosis of pancreatic cancer[J].Oncotarget.2016 Aug 9;7（32）：51301-51310.