固本平喘方纳米脂质体雾化吸入剂改善哮喘豚鼠病理状态的研究

贯剑 宋红普 张晓晓 张彤

【摘要】目的：研究固本平喘方雾化吸入后治疗效果。方法：将39只豚鼠分为正常对照组、哮喘模型组、中药对照组、固本平喘吸入剂小剂量组、固本平喘吸入剂大剂量组、西药对照组6组，采用固本平喘中医纳米脂质体雾化吸入，观察一般情况、血常规和病理改变。结果：模型组与其他组比较，白细胞（WBC）、嗜酸性细胞（EO）水平明显升高，差异有统计学意义。正常组由于雾化等因素影响，存在肺动脉壁增厚和轻微炎症的情况。哮喘模型组的炎症情况最为严重，动脉壁增厚。中药对照组炎症情况减轻，伴有肉芽组织增生。结论：固本平喘方纳米脂质体雾化吸入剂对哮喘豚鼠的病理学有一定的改善作用。

【关键词】固本平喘方;雾化吸入;哮喘;豚鼠;病理学

【中图分类号】R285.5【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2022）11-0009-05

StudyonthePathologicalStateoftheNebulizedNanoliposome

InhalationofGubenPingchuanFormulaonAsthmaticGuineaPigs

GUANJian1SONGHongpu2ZHANGXiaoxiao3ZHANGTong2

1.LiangyuanHospitaloftraditionalChinesemedicine，Shangqiu476000，China;

2.ShanghaiUniversityoftraditionalChinesemedicine，Shanghai200030，China;

3.PutuoHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityoftraditionalChinesemedicine，Shanghai200062，China

Abstract：ObjectiveToassesstheinhalationtherapyofnebulizedGubenPingchuan.Method39guineapigsweredividedintosixgroups：normalcontrolgroup，asthmamodelgroup，traditionalChinesemedicinecontrolgroup，GubenPingchuanlow-doseinhalationgroup，GubenPingchuanhigh-doseinhalationgroup，andWesternmedicinecontrolgroup.ThenebulizednanoliposomesofGubenPingchuanwereinhaledbythesixgroupsandwemeasuredtheallergy-relatedimmunologicalindicators.ResultThelevelsofWBCandeosinophil（EO）weresignificantlyhigherinmodelgroupandothergroups.Thenormalgrouphadpulmonaryarterywallthickeningandslightinflammationduetoatomizationandotherfactors.Theinflammationofasthmamodelgroupwasthemostserious，andthearterialwallwasthickened.Inthecontrolgroup，inflammationwasalleviated，accompaniedbygranulationtissuehyperplasia.ConclusionThenebulizednanoliposomeinhalationofGubenPingchuancouldimprovethepathologyofasthmaticguineapigstoacertainextent.

Keywords：GubenPingchuanFormula;NebulizedInhalation;Asthma;GuineaPigs;Pathologically

固本平喘方具有益气平喘、脱敏解毒的功效，笔者在临床上长期使用雾化吸入剂治疗哮喘有较好效果，但方式多为简单的雾化吸入，多数临床观察[1-3]仅停留在经验层面，实验研究的机理不明确，本项研究，通过动物实验来客观地观察和评价其治疗效果，探讨其在细胞的作用机理。

1实验材料

1.1药物

1.1.1治疗用药固本平喘雾化吸入剂（以下简称固本平喘方）：每毫升含1g生药量，由上海中医药大学中药学院提供。

1.1.2阳性对照药小青龙合剂（湖北福广制药有限公司生产，国药准字Z42021495）。功能主治是解表化饮，止咳平喘，用于风寒水饮，恶寒发热，无汗，喘咳痰稀。每支装10mL。

1.2实验动物英国种普通级健康豚鼠39只，体重250～300g，均由上海中医药大学实验动物中心提供，普通级，实验动物合格证号[上海中医药大学实验动物中心SYXK（沪）2004-0005]。

1.3设备与试剂

1.3.1设备贝尔思超声雾化器（BSW-2A型）由鞍山市贝尔思电子有限公司生产。希森美康（XE-2100）全自动血球分析装置，由日本SYSMEXCORPORATIION公司生产。莱卡SP1600切片机由上海莱卡仪器有限公司生产。奥林巴斯CX31显微镜。隔水式恒温箱（PYX-DHS型）上海跃进医疗器械一厂生产。

1.3.2试剂卵蛋白粉（OVA），国药集团化学试剂有限公司生产（批号：F20110811）。

2实验方法

2.1造模方法将豚鼠正常饲养1周后开始进行致敏。第1天，先用75%乙醇溶液消毒局部皮肤后，给哮喘模型组、高剂量组、低劑量组及中药对照组、西药对照组每只豚鼠腹腔注射10%卵蛋白生理盐水溶液1.6mL（6mL/kg，另有0.1mL损耗）致敏。空白对照组用0.9%生理盐水。第8天，再次注射致敏，各组剂量和方法同前。

2.2模型评价指标第14天开始激发引喘，将豚鼠置于4L的玻璃钟罩内用1%卵蛋白雾化吸入15～30s，观察20～30s，诱发哮喘发作（说明模型成功）。如豚鼠出现抽搐，马上将其取出。以后隔天进行1次引喘，至实验结束。同时，从第14天起，引喘后1h各组进行相应治疗。至第28天，各组动物处死，提取样本。

2.3分组与治疗方法A正常对照组：致敏、激发以及治疗均以0.9%生理盐水代替。B哮喘模型组：造模成功后每天吸入1%OVA溶液激发1次。C中药对照组：雾化吸入小青龙合剂1g/次。D固本平喘吸入剂小剂量组：雾化吸入剂1g/次。E固本平喘吸入剂大剂量组：雾化吸入剂3g/次。F西药对照组：雾化吸入地塞米松1g/次。

2.4血常规检测采用全自动血球分析装置自动分析血常规全套。

2.5肺组织病理学检查各组豚鼠分别于末次激发后24h内用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉下开胸。取右肺下叶组织，置4%甲醛固定，24h后酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片行HE染色，光镜下观察支气管周围炎性病变。

2.5.1肺组织切片制备①切取标本同一部位组织，大小约2mm×1mm×1mm;②以乙醇进行梯度脱水（80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次）;③浸二甲苯2次，以透明;④用58℃低熔点石蜡浸蜡2次;⑤包埋蜡块;⑥5um常规切片，裱于防脱片剂处理过的干净载玻片上;⑦置60℃恒温箱中烤片3h，备用。

2.5.2肺组织HE染色①切片以二甲苯脱蜡2次;②以乙醇进行梯度脱水（100%乙醇3次、95%乙醇2次、80%乙醇1次）;③在蒸馏水中停留2min后，以苏木素溶液染细胞核;④自来水冲洗，去掉浮色;⑤1%盐酸酒精分化;⑥蒸馏水漂洗后，以1%伊红酒精溶液染细胞质;⑦以乙醇进行梯度脱水（80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次）;⑧以二甲苯透明，树脂胶封片。光镜下观察。

2.6统计学方法应用SPSS12.0统计软件进行统计分析。所有计量数据均以均数加减标准差（x±s）方式表示，多组之间均数比较采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

3结果

3.1一般情况变化各组在被激发后症状表现不同，正常对照A组豚鼠表现精神活跃、反应灵敏、呼吸平稳，无明显呼吸急促、困难和喘鸣音，模型组合各用药组豚鼠在吸入OVA后不久出现躁动、搔抓颜面等情况，部分豚鼠出现呼吸急促、腹式呼吸，甚至哮鸣音等。在末次激发时，小剂量治疗D组豚鼠未出现哮鸣音和呼吸困难，其他各治疗组均有2～3只豚鼠出现轻度呼吸急促、喘鸣等情况。

3.2血常规变化模型组与其他组比较，WBC、EO水平明显升高，差异有统计学意义。正常组较其他各组的EO水平均低，差异有统计学意义。D、E、F组的BA水平与模型组比较显著增高，D、F组与C组比较亦有差异。A组与B组的PMN差别有统计意义，其余各组无差别。B组与A组比较，LY有显著差别，D、E、F组与B组的差别也有统计学意义。详见表1。

3.3固本喘方对病理学的影响肺组织病理学观察变化情况，A正常对照组：支气管及周围肺组织结构清晰，肺动脉壁轻度增厚，有2例伴有轻度间质性肺炎。B哮喘模型组：肺动脉壁增厚，细支气管腔内充满炎性分泌物，有2例伴有肺间质纤维组织增生。C中药对照组：肺内细支气管壁及管周见少量炎细胞浸润，腔内少量分泌物。小灶性肺组织结构破坏，伴部分肉芽组织增生。D固本平喘吸入剂小：肺动脉壁增厚，细支气管腔内少量分泌物，3例出现轻度间质性肺炎和局部间质性肺炎。E固本平喘吸入剂大：1肺动脉壁增厚，轻度间质性肺炎。2例出现局部肺组织破坏，伴肉芽组织增生。F西药对照组：肺动脉壁增厚，轻度间质性肺炎。2例出现肺组织结构破坏，另有1例局部肺出血。A组：图①、②;B组：图③、④;C组：图⑤、⑥;D组：图⑦、⑧;E组：图⑨、⑩;F组：图B11、B12（如下图所示）。

4讨论

支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，反复接触过敏原导致变态反应性炎症是多数哮喘发作的基本机制。中药复方固本平喘方（包括黄芪、白术、黄芩、甘草、麻黄、乌梅等）是临床经验方基础上结合现代研究进展优化配伍而成，具有益气平喘、脱敏解毒的功效。中药雾化吸入剂治疗哮喘有较好效果，但方式多为简单的雾化吸入，多数临床观察仅停留在经验层面，实验研究的机理不明确。

白细胞（WBC）升高是细菌性炎症的主要表现，但是在哮喘动物实验中也发现存在外周血WBC增高的情况，有研究[4]表明中药复方能显著降低大鼠外周血WBC，较模型组有显著差异。哮喘炎症的特征性标志是嗜酸性细胞（EOS）的浸润，EOS细胞浆中含有嗜酸性细胞阳离子蛋白（ECP）、碱性蛋白（MBP）、嗜酸细胞衍生的神经毒素（EDN）、嗜酸细胞过氧化物酶（EPO）等特殊蛋白质颗粒以及多种炎症介质、细胞因子和氧自由基，EOS释放组胺，产生气道高反应性（AHR），因此EOS是引起迟发相变态反应和气道高反应性的关键细胞，在介导气道变应性炎症参与支气管哮喘发病的调节中起重要作用[5]。同时，EOS在气道的缓解期也处于高水平，与晚期哮喘反应和气道高反应性关系密切[6]。淋巴细胞（LY）包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，EOS分化、成熟、聚集又依赖于淋巴细胞的活化及其产生的细胞因子来调节，因此淋巴细胞在哮喘发病中也起了关键作用，它影响哮喘的发生和哮喘气道炎症及气道高反应性，其中T淋巴细胞具有“中枢性”调节作用[7]。笔者研究发现，模型组与其他组比较WBC、EO水平明显升高，差异有统计学意义，说明模型组的血液中EO增多，处于一种致敏状态。正常组较其他各组的EO水平均低，差异有统计学意义。B组与A组比较，LY有显著差别，D、E、F组与B组的差别也有统计学意义，提示造模后的豚鼠LY明显升高，而两个治疗组和西药组对于豚鼠外周血的LY有降低作用。

从各组的病理结果可以看出，正常组由于雾化等因素影响，存在肺动脉壁增厚和轻微炎症的情况。哮喘模型组的炎症情况最为严重，动脉壁增厚。中药对照组炎症情况减轻，伴有肉芽组织增生。两组治疗组同样有肺动脉增厚，并有轻度炎症存在。西药组存在肺组织结构受到破坏的情况，以上不排除外界感染的可能。

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（收稿日期：2022-02-25编辑：陶希睿）

基金项目：上海市科委项目[固本平喘雾化吸入剂对哮喘豚鼠信号转导和转录激活因6（STAT6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达影响的实验研究]。项目编号：8ZR1416200。

作者简介：贯剑（1973-），男，满族，博士，副主任医师，研究方向为中医药治疗过敏性疾病的临床和实验研究。E-mail：475479521@qq.com