液态奶中的三聚氰胺检测方法探讨液相色谱-串联质谱法

叶夏声　何玉榆　黄婷　邱永为

摘  要：本研究基于高效液相色谱-串联质谱法建立了一种高精密度检测三聚氰胺的方法，并对所建立的方法进行了方法学的考察与验证，参考已有的标准，对标准的相关处理步骤进行优化，采用高效液相色谱-串联质谱法进行分析。结果发现，其标准曲线相关系数为0.998 592，方法检出限为0.001 5 μg/kg，回收率范围为87.79%～104.54%，相对标准偏差为2.39%～5.07%。由此表明，该方法检出限低，回收率较好，精准度高，重复性好，为液态奶中的三聚氰胺检测提供了有力的方法支撑。

关键词：三聚氰胺;高效液相色谱-串联质谱;高精密度;高回收率

中图分类号：S859.84 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2022）04-0098-03

三聚氰胺（melamine）（化学式为C3H6N6），相对分子量为126.12，俗称密胺、蛋白精，国际纯化学和应用化学联合会（international union of pure and applied chemistry chemical nomenclature，IUPAC）命名为“1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺”，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，是有机化工业的常用材料，广泛应用于木材加工、化学涂料、高分子塑料等多个领域[1]。在传统的检测方法中，凯氏定氮法只能测定待测物的含氮量，进而推算出其蛋白质的含量，忽略了氮元素的来源及种类，故被非法商家利用此漏洞将三聚氰胺添加至乳制品中，塑造蛋白质含量高的假象。此类产品被人食用后会严重影响人的身体健康，长期食用可能会导致膀胱结石、肾结石、肾衰竭，泌尿系统未成熟的婴幼儿食用后将会受到更大的影响，曾经在社会上造成过恶劣影响[2]。在GB/T22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中原料乳及乳制品中三聚氰胺的限量值分别为：婴儿配方食品限量要求1.0 mg/kg;其他食品限量要求     2.5 mg/kg[3]。故研究和开发出高效的三聚氰胺检出分析技术一直是食品安全检测领域的热点。

常用的三聚氰胺检测方法有酶联免疫试剂盒检测法（ELSAE）、胶体金试纸条法、气相色谱-质谱检测法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-gas chromatography/mass spectrometer，LC-MS/MS）等[4-8]。其中，液相色谱-串联质谱法将色谱的高分离能力与质谱的高灵敏度和高选择性优点相结合，既可以定性又可以定量，应用前景广阔[5-6]。本研究将基于液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），对液态奶中三聚氰胺检测方法进行进一步研究，优化前处理步骤，用二乙胺乙腈水溶液作为提取液超声提取液态奶中的三聚氰胺，离心后过滤，滤液无需净化，用氮吹仪吹干，之后用甲醇进行复溶。该方法不仅免除了传统方法中固相萃取的繁琐步骤，消除牛奶基质的影响，增强了抗干扰能力，还降低了检出限，提高了定量检测的重现性。整个前处理步骤较为简单，节约了时间，降低了成本，实现了更快更准地测定液态奶中三聚氰胺的含量，为液态奶的安全食用提供技术保障。

1  材料与方法

1.1 设备与试剂

1.1.1 儀器设备

试验所用的安捷伦1290液相色谱仪、AB Science质谱仪、氮吹仪、混合仪、梅特勒天平、旋涡混合器、冷冻离心机、超纯水仪、超声波清洗机购自相关生产厂家。

1.1.2 药品与试剂

标准物质：三聚氰胺（德国DR公司生产，纯度99.5%）

试剂：甲醇、二乙胺和乙腈均为德国默克产品（HPLC级，纯度≥98%）

复溶液：甲醇/水（v/v=20∶80）

1.2 样品准备

取适量新鲜液态奶，于-20 ℃下避光  保存。

1.3 标准储备液和混合标准工作液的配制

准备三聚氰胺的标准品，精确称取适量，用甲醇配成10 ?g/mL的标准储备液，  -18 ℃冰箱中保存，有效期6个月;再分别移取适量地三聚氰胺标准储备液，用甲醇逐级稀释成适当浓度的三聚氰胺标准工作液。

1.4 样品前处理

准确称取2.00 g（±0.01 g）试样，置于 15 mL刻度试管中，加入7 mL乙腈，使用涡旋仪振荡1 min，后加入1 mL二乙胺，用水定容至10 mL，涡旋振荡1 min，超声提取15 min，8 000 r/min低温离心8 min（4 ℃），过滤后备用。移取2 mL在80 ℃下氮气吹干，用1 mL的20%甲醇溶液复溶，装瓶后供高效液相色谱串联质谱上机测定。

2  结果与讨论

2.1 标准曲线

按GB/T22388—2008 《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中的条件设置仪器参数，配制一系列浓度的标准样品溶液        （0.01 ?g/mL、0.05 ?g/mL、0.10 ?g/mL、  0.20 ?g/mL、0.50 ?g/mL），待仪器平稳后，对相应标准品溶液进行测定，绘制曲线，其相关系数R²=0.998 592，该曲线的R2值符合实验要求。

2.2 检出限测定

以空白牛奶样品为基质，一个阳性添加浓度C（10.0 ?g/g），按照上述优化过的方法来前处理和上机，所得信噪比S/N=19.49，可计算检出限为0.001 5 ?g/g。计算公式如下：

检出限（method detection limit，MDL）（μg/g） =3C/（S/N）

2.3 回收率和精密度的确定

以空白牛奶作为基质，进行相应的加标回收试验，加标浓度为10 ?g/kg、50 ?g/kg、200 ?g/kg。每个加标浓度分别做6个相同浓度的平行试样，根据上述检测方法进行前处理和仪器测定，方法精密度和回收率结果分别见表1、表2所示。

3  结论

本研究探索优化了一种基于高效液相色谱-串联质谱法的内标法测定液态奶中三聚氰胺的分析方法。该方法通过用含10%二乙胺的乙腈水溶液充分提取，取上清液进行氮吹浓缩后，定容上机测定，最后，该方法的检出限达到了0.001 5 μg/g，能灵敏的检测低含量基质，同时，液态奶试样在按10 μg/kg、     50 μg/kg、200 μg/kg 3个浓度添加情况下，根据该试验方法进行前处理和仪器检测，结果回收率为87.79%～104.54%，相对标准偏差为2.39%～5.07%。该方法具有前处理简单便捷、检出结果精密度高、定量结果准确且重复测试较为稳定等特点，大大提高了液态奶中三聚氰胺的检测效率，方便对此类药物的监督管控，对有效的倒逼生产养殖端按规定使用该类药物起到积极推动作用。

参考文献

[1] 赵瑞，杨世杰，杨艳，等.乳制品中三聚氰胺检测方法研究进展[J].中国乳业，2021（05）：69-77.

[2] 於小惠，赵蓓.水产制品中三聚氰胺檢测方法分析[J].食品安全导刊，2021（21）：177-178.

[3] 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法：GB/T 22388-2008[S].2008.

[4] 袁园.高效液相色谱法测定乳制品三聚氰胺的含量研究[J].轻工科技，2021，37（9）：15-16.

[5] 刘少杰，黄菲菲，杨其帆，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时检测尿中三聚氰胺及其同系物[J].卫生研究，2022，51（1）：85-90，98.

[6] 冯光宝，闫跃飞，高娜，等.超高效液相色谱串联质谱检测配合饲料中三聚氰胺的方法研究[J].  粮食与饲料工业，2022（2）：68-71.

[7] 张淑芳，崔婷婷.HPLC法测定含乳饮料中的三聚氰胺[J].食品安全导刊，2022（13）：66-68.

[8] 梁晨，彭浩，郑秀瑾，等.离子色谱法测定化肥中的无机阴离子和三聚氰胺[J].湖北农业科学，2021，60（13）：114-118.