菊花含量测定方法提高

王小芳　郑倩倩　路丽娟

【摘 要】 目的：改进《中国药典》中菊花含量测定方法，使其中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸与其同分异构体1，5-O-二咖啡酰基奎宁酸得到良好分离，提高测定结果准确性。方法：Inertsil ODS-3 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸溶液梯度洗脱，检测波长为348 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL。结果：绿原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸分离良好，在12.583～314.582、12.595～314.878、15.599～389.978 μg/mL的范围内呈现良好的线性关系（r=0.9999、1.0000、0.9995）;平均加样回收率分别为98.21%、102.18%、97.77%，RSD为1.54%、0.99%、1.01%（n=6）。结论：该方法专属性强，准确、灵敏，解决了现行方法的问题。

【关键词】 菊花;含量测定;3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸

【中图分类号】R927.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2022）01-0044-05

Improve Chinese Pharmacopoeia Contentdetermination of Chrysanthemum Morifolium Ramat.

WANG Xiaofang ZHENG Qianqian LU Lijuan

Shijiazhuang Institute for Food and Drug Control，Shijiazhuang 050011， China

Abstract：Objective To improve contentdetermination of Chrysanthemum morifolium Ramat. in the current Chinese Pharmacopoeia to well separate 3，5-O- Dicaffeoyl quinic acid. Methods Inertsil ODS-3 C18 （4.6×250 mm，5 μm） ，with the mobil phase comprising of acetonitrile- methanol -0.2%ice acetate flowing at 1mL/min in a gradient elution manner， and the detection wavelengths were set at 348 nm，and the column temperature was 30 ℃.Results The linear ranges of chlorogenic acid， luteolin， 3，5-O-dicaffeoyl quininic acid fell into 12.583～314.582 μg/mL （r=0.9999）、12.595～314.878 μg/mL（r=1.0000）、15.599～389.978 μg/mL（r=0.9995）respectively.The average recovery of chlorogenic acid， luteolin， 3， 5-O-dicaffeoyl quininic acid were 98.21%、102.18%、97.77%with the RSDs of 1.54%、0.99%、1.01%（n=6）.Conclusion The new mothed is specific，accurate and sensitive. It solves the problems of the current Chinese pharmacopoeia mothed.

Key words：

Chrysanthemum Morifolium Ramat.; Content Eetermination; 3，5- Dicaffeoylquinic Acid

菊花為菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序。具有散风清热、平肝明目、清热解毒的功效，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒。药理研究表明菊花具有抗病毒、抑菌、抗炎、抗氧化等药理作用，其主要成分为黄酮类、有机酸类、挥发油类等。

该品种现行标准为2020版《中国药典》，含量测定以绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸3个成分作为其质控成分，采用高效液相色谱法，以乙腈-0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱。但在日常检验中发现，采用药典方法测定含量时3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸与其同分异构体1，5-O-二咖啡酰基奎宁酸不能有效分离，导致计算结果偏差较大，不能真实反应该成分含量，需要对现有方法进行改进。虽然近年来关于菊花多成分测定的报道较多，但并未检索到能将二者有效分离的高效液相色谱方法。因此本实验对菊花含量测定方法进行改进，通过改变流动相对色谱条件进行改进和优化，实现对3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的有效分离，从而提高检测结果的准确性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters ARC高效液相色谱仪（美国Waters公司）;CPA225D电子天平（德国赛多利斯公司）;Elmasonic P 超声波清洗仪（德国Elma公司）;水浴锅（天津泰斯特）。

1.2 试药 绿原酸对照品（批号：110753-201716，纯度以99.3%计）、木犀草苷对照品（批号：111720-201408，纯度以94.8%计）、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品（批号：111782-201706，纯度以97.3%计）均购自中国食品药品检定研究院;1，5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号：E-0447-18042523，上海同田生物技术股份有限公司）。乙腈、甲醇、冰醋酸、磷酸均为色谱纯;水为超纯水。4批菊花（购自市场）经本中心毕飞霞老师鉴定为菊科植物菊 Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序，样品1为杭白菊、样品2～4为贡菊。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性 试验Inertsil ODS-3 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸溶液梯度洗脱，程序见表1，检测波长为348 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL。

本方法，绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸各峰的理论板数均大于10000，分离度均大于1.5。本方法和药典方法条件下，对照品和供试品色谱图如图1所示。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品储备液和混合对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品适量，加70%甲醇分别制成含绿原酸1.5729 mg/mL、木犀草苷1.5744 mg/mL、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸1.9499 mg/mL的对照品储备液。分别精密吸取上述储备液各1 mL，用70%甲醇定容至25 mL，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取菊花粉末（过一号筛）约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率45 kHz）40 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学评价

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下的各对照品储备液1 mL置5、10、25、50 mL量瓶、2 mL置250 mL量瓶，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得稀释5、10、25、50、125倍的5 个浓度梯度的线性考察混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以对照品浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度考察 取2.3.3项下制备的样品溶液1份，按照2.1项下色谱条件进行测定，连续进样6次，记录色谱图峰面积，测得绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD值分别为0.85%、0.44%、0.52%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性考察 取同一批供试品，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”色谱条件下进样测定，测得6份样品中绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量的RSD值分别为0.64%、1.41%、1.03%，表明該方法重复性良好。

2.3.4 回收率试验 精密称取同一批供试品约0.125 g，共6份，置于具塞锥形瓶中，精密加入各对照品，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”色谱条件下进样测定，计算回收率。结果见表3，结果说明该方法的准确度良好。

2.3.5 稳定性考察 取2.3.3项下制备的样品溶液1份，按照2.1项下色谱条件进行测定，分别在0、2、6、8、16、24 h进样，记录色谱图，计算3种成分峰面积的RSD值，绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量的RSD值分别为1.25%、0.66%、0.55%，表明该方法稳定性良好。

2.3.6 色谱柱耐用性试验 取同一批样品，照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，对不同品牌色谱柱的耐用性进行考察，并计算含量。其中Agilent 5Tc-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱在2.1色谱条件下木犀草苷和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的分离度均小于1.5。TechMate C18-ST（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）系统适用性较好，结果见表4。

2.3.7 样品的测定 按2.2.2项下方法，制备4批菊花供试品溶液，按2.1项下色谱条件和药典方法分别进行含量测定，记录峰面积，按干燥品计算样品中绿原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量。结果见表5。

3 讨论

3.1 分析条件的优化 实验过程中首先选用了3种不同品牌色谱柱Agilent 5Tc-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）、TechMate C18-ST（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm），在药典方法乙腈-0.1%磷酸溶液的基础上调整流动相比例，但3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和1，5-O-二咖啡酰基奎宁酸均重合在一起，无法分离。之后改变流动相组成，采用甲醇-磷酸溶液系统，可使3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和1，5-O-二咖啡酰基奎宁酸分离度大于1.5，但木犀草苷分离度小于1.5。后又试验了乙腈-甲醇-0.1%磷酸系统和乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸系统，发现，乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸梯度洗脱各成分分离度较好，绿原酸、木犀草苷，3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸分离度均大于1.5，最终选择该系统梯度洗脱。

3.2 检测波长的选择 通过扫描200～400 nm波长范围内的紫外吸收，发现绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的最大吸收分别为326.1、348.8、327.3 nm，绿原酸和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸在327 nm与348 nm处的峰面积比接近1.8，木犀草苷在327 nm与348 nm处的峰面积比接近0.8，如果检测波长选择327 nm对3种成分峰面积影响较小，但是由于木犀草苷的含量较低，峰面积较小，对其准确度影响较大，因此本方法还是采用药典方法的348 nm。

3.3 2020版《中国药典》菊花含量测定 方法中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸与1，5-O-二咖啡酰基奎宁酸不仅出峰时间一致，且二者混合物的紫外吸收与3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸也完全一致（如图2所示），在日常检验中很容易误判，造成检验结果的误差。药典菊花中3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的限度为不得少于0.70%，由样品测定结果可以看出，3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量前后相差较大，有的甚至会影响其是否合格的判定。相比药典方法，本方法解决了3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的分离问题，检测结果更加可靠。

本实验采用的新方法能较好的分离菊花中的绿原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸，具有较高的灵敏度和准确度，重现性好，解决了现行方法3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸与1，5-O-二咖啡酰基奎宁酸不能分离的问题，可作为该品种含量方法改进的参考。

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（收稿日期：2021-05-06 编辑：陶希睿）