伪狂犬病毒FJ 2012株感染湖羊肾脏的转录组谱特征及对FoxO通路的影响

彭瑶顺, 李方瑾, 徐佳汇, 戰 婷, 王全溪,2, 周伦江

(1.福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)，福建 福州 350002；2.福建省兽医中药与动物保健重点实验室(福建农林大学)，福建 福州 350002；3.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州 350013)

伪狂犬病是伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus, PRV)感染多宿主的一种急性传染病，宿主包括猪、牛、羊等经济动物及一些野生动物[1].我国羊伪狂犬病毒感染最早报道于20世纪50年代，近年来由于猪的流动性增加，以及羊的养殖规模逐渐扩大，羊感染PRV的报道也逐年增多[2].羊感染PRV主要为口吐白沫，皮肤局部痒，体温升高，最后严重者死亡，剖检病理变化常见于肺出血明显，脑实质水肿出血，肾脏表面有出血点[3].但是有关羊感染PRV的致病机制研究鲜有报道.

基于RNA-seq的高通量测序主要应用于筛选差异基因、预测新转录本及基因功能分析等方面，有助于从分子水平研究病毒入侵宿主以及宿主的防御机制[4,5].Fan et al[6,7]基于转录组数据对感染了PRV的大鼠脑、肺、脾脏等组织进行分析，结果表明，miR-122-5p具有调控NOD2-RIP2信号通路的功能，从而抑制该信号通路调控的促炎反应，为伪狂犬病毒逃避宿主免疫应答的研究提供依据.

湖羊属于绵羊，在南方如江浙一带饲养相对较多[8].肾脏是PRV侵害湖羊的器官之一.PRV感染如何导致肾脏病变，通过何种途径对其进行调控尚未明了.本试验基于PRV FJ 2012株，以湖羊为模式动物，借助RNA-seq技术，对PRV人工感染湖羊的肾脏转录组进行分析，了解伪狂犬病毒感染羊的致病机制.

1 材料与方法

1.1 动物及分组

5月龄湖羊8头，均购买自闽侯某大型养殖场，并经PCR检测确认PRV抗原阴性和ELISA检测抗体阴性.PRV FJ 2012株由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存并提供.动物使用全价料进行适应性饲养，随后将湖羊随机且平均分成空白对照组和PRV攻毒组.PRV攻毒组(5头)颈部皮下注射病毒悬液1 mL·只-1(TCID50=103mL)，空白对照组每头样本注射灭菌生理盐水1 mL.攻毒后7 d内每日进行临床观察，对有呼吸困难、共济失调等临床症状的湖羊进行解剖，采集肾脏，保存于已装有RNAhold的5 mL离心管，随后转入-80 ℃冻存.

1.2 总RNA的提取

肾组织总RNA提取按照RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN)说明书进行，使用Nanodrop 2000测定样品RNA浓度和光密度值D，并使用1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA质量，符合质量的RNA送至北京诺禾致源基因公司进行转录组测序分析.

1.3 样品质量测序评估分析

使用Illumina公司的第二代测序技术，获取了送检样品的原始数据.由于在测序过程中伴随着核酸片段的打断以及接头等过程，所以序列数据参差不齐.因此，需要对获得的数据进行筛选.该过程包含：剔除带接头的reads、含有N的reads以及Q≤20的低质量reads[9].同时，对去杂质后的干净数据进行Q20、Q30和GC含量计算.使用CASAVA处理获取的原始数据并用于后续分析[8].

1.4 差异表达基因分析

根据基因长度计算每个基因的FPKM，并计算映射到该基因的读数.FPKM指每百万碱基对测序的转录本序列片段的每千碱基片段的预期数量，是当前最常用的检测评估方法，以|Log2(FoldChange)|>0,P<0.05为差异表达基因[8].

两组之间的差异表达使用DESeq2软件(1.16.1)进行分析.Benjamini和Hochberg调整P值，P<0.05的基因即为差异表达基因.对差异检验的P-value作多重假设检验校正，通过控制伪发现率(false discovery rate, FDR)决定P-value的域值[8].

1.5 GO和KEGG富集分析

GO (gene ontology)富集分析主要通过ClusterProfiler (3.4.4)软件对所有筛选的差异表达基因进行生物功能分析.将阈值定为P≤0.05，对符合要求的GO term进行差异富集.通过Cluster Profiler (3.4.4)软件将差异表达基因富集到不同的KEGG通路，分析生物体内的各种信号通路.通路显著性富集分析以KEGG pathway为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组相比较后差异表达基因中显著性富集的pathway[8].

1.6 差异基因的qPCR检测结果

为了验证转录组数据，本试验着重对FOXO通路的差异表达基因进行了qPCR验证.首先在NCBI中查找基因序列(STAT3：XM_015098787.2，FoxO3：NM_001267889.1，BCL6：XM_012097363.3，ATG8：XM_012175401.3，IL6：NM_001009392.1，SGK2：XM_004014577.4，PEPCK：XM_027977017.1，ACTROGIN：XM_004011657.4，IRS：XM_015093559.2，β-肌动蛋白：X00182.1)，并采用Primer 15.0设计特异性引物(表1).将PRV感染后所采集的羊肾脏进行总RNA提取，反转录为cDNA,作为qPCR模板.反应条件为：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s+60 ℃ 30 s，40个循环.β-肌动蛋白基因作为参考基因，使用-ΔΔCt法计算差异表达基因的log2(fold change).

表1 qPCR引物的序列Table 1 Sequences of qPCR primers

2 结果与分析

2.1 总RNA质量检测结果分析

PRV FJ 2012株人工感染湖羊，体温最高达42.5 ℃，皮肤瘙痒，神经症状和口吐白沫.感染后第5天共死亡4只，剖检采集肾脏.感染后第7天，剖检感染组和对照组所有羊，采集肾脏.提取所有样品总RNA送生物公司测序.对照组和人工感染组肾脏的8个样本，通过转录组测序质量分析结果表明(表2)，共获得测序长度为43 776 562～48 202 572个原始片段(raw reads)，各样本有效片段(clean reads)最低可达到6.4G，Q30(测序错误率小于0.1%)均在93.64%以上，GC含量均在47.95%以上，证明数据可靠，可以进行后续的生物学分析.

2.2 差异表达基因的筛选

通过对转录组测序中筛选到的有效数据进行分析，发现PRV FJ 2012株感染湖羊与空白对照组湖羊的肾脏有2 679个差异表达基因，其中1 269个基因下调，1 410个基因上调(图1)，表明伪狂犬病毒感染湖羊肾脏，激活肾脏启动大量的基因应答.

图1 PRV感染湖羊肾脏中差异表达基因筛选结果Fig.1 Screening of differentially expressed genes in Hu sheep kidney infected with PRV

2.3 GO富集分析

将筛选到的差异表达基因进行GO富集分析，GO分为3个主要功能类别，即生物过程、细胞组分和分子功能.选取富集基因数大于2个的GO条目，按照富集显著性P-value值，筛选到显著富集的前10个GO条目(图2).在生物过程方面，显著富集的GO Term主要是蛋白折叠、GPI锚定代谢过程、蛋白质脂质化功能；在细胞组分方面，显著富集的GO Term主要是细胞核、染色质、细胞外间隙等；在分子功能方面，显著富集的GO Term主要是未折叠蛋白结合、热休克蛋白结合、序列特异性DNA结合等.

图2 差异表达基因的GO富集分析结果Fig.2 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

2.4 KEGG通路分析

为了对差异表达基因进行KEGG通路分析，使用在线分析软件DAVID将基因的ID号比对到KEGG数据库，富集出病毒感染后差异表达的基因可能参与的通路.通过对攻毒组与空白组富集到的DEGs分析表明，富集到的差异通路有316条，其中差异显著的通路有7条(P<0.05)(图3).包括FoxO信号通路，真核生物核糖体生物发生，TNF信号通路，沙门氏菌感染，IL-17信号通路，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用(AGE-RAGE signaling pathway in diabeticcomplications)等信号通路.

图3 差异表达基因的KEGG富集结果Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes

2.5 qPCR验证肾脏中FOXO信号通路DGEs的mRNA表达结果

为了验证转录组数据，本试验选择FOXO3通路，验证了STAT3、IL-6、FOXO3、BCL6、ATG8、IRS、SGK2、ATROGIN、PEPCK等DEGs.攻毒组与空白对照组相比STAT3、IL-6、FOXO3、BCL6、ATG8等基因的mRNA水平上调，IRS、SGK2、ATROGIN、PEPCK的mRNA水平下调，qPCR结果与转录组测序数据结果一致(表3).可见，转录组的数据可靠，PRV感染湖羊肾脏调控了肾脏中FOXO3通路的多个基因表达.

表3 qPCR验证肾脏中差异表达基因mRNA的表达结果Table 3 Validation of mRNA expressions of differentially expressed genes in Hu sheep kidney by qPCR

3 讨论

RNA-seq技术作为新一代的测序技术，主要应用于检测差异基因、预测新转录本以及基因功能分析等方面.RNA-seq技术有助于从转录组水平研究病毒入侵宿主以及宿主的分子机制.有研究表明[5]，PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞后，与IL-15产生相关的5个基因(IFNb1、IL-15、IRF1、JAK2和STAT1)均上调，这部分解释了PRRSV感染后导致的高炎症反应.龚小程等[10]利用RNA-seq技术研究CSFVShimen株与宿主细胞的相互作用，研究表明双细胞系差异基因主要集中在NF-κB相关的通路，低NF-κB活性的细胞对流感病毒具有抵抗性，推测CSFV感染过程中NF-κB通路的活化会影响病毒的侵染.Jin et al[11]通过RNA-seq技术研究表明，PRV感染细胞后长链非编码RNA的沉默LncA02830可显著上调IRF3、干扰素β和MX1的转录水平，抑制PRV-Ⅱ的复制.因此，合理使用RNA-seq技术有助于深入了解病毒的致病机理.

本试验对伪狂犬病毒感染湖羊肾脏进行RNA-seq测序共筛选到2 679个DEGs，这些DEGs参与29个生物学功能，主要涉及生物代谢、信号传导、细胞周期等相关基因网络.在分子功能方面的GO功能富集中发现，未折叠蛋白结合显著增多，对KEGG通路分析发现PERK蛋白表达上升，这表明PRV感染湖羊肾脏引起内质网应激.自噬相关蛋白基因表达上调(ATG8,ATG12)，推测伪狂犬病毒导致内质网应激后进一步诱导细胞产生自噬，这可能与病毒的复制有关.

已有研究表明[12]，PRV与细胞自噬存在关联，伪狂犬病毒感染早期(0～6 h)促进细胞自噬，后期通过激活PI3K/AKT/mTORC1途径抑制自噬来增加感染性病毒粒子的数量.同时，揭示了伪狂犬病毒被膜蛋白US3抑制LC3-Ⅰ转变为成熟LC3-Ⅱ的过程.通过伪狂犬病毒侵染PK-15的试验表明[15]，Beclin1抑制bcl-2与bcl-xl相结合，再将Neuro-2a细胞人工感染伪狂犬病毒，确认了PRV通过经典的Beclin-1-ATG7-ATG5途径诱导Neuro-2a细胞自噬，促进病毒在体外的复制.

FOXO是转录因子叉头框蛋白O.FOXO功能广泛，参与细胞的自噬、凋亡、新城代谢等过程[13].FOXO受到上游蛋白AKT的调控，活化的AKT磷酸化FOXO，然后转运到细胞质中，从而失去转录调控功能[14].通过对FOXO信号通路分析表明，伪狂犬病毒感染湖羊肾脏会导致IL-6、STAT3、FOXO3、ATG8等基因的mRNA上调.研究显示，细胞质中STAT3通过隔离EIF2AK2以及与其他自噬相关信号分子如FOXO1和FOXO3相互作用，结构性地抑制自噬.张晓芹通过免疫组织化学和qPCR两种方法检测结肠癌组织中的STAT3和IL-6表达水平，发现两者呈现出明显的正相关，IL-6-STAT3与结肠癌发展有关[15].VZV在细胞复制过程中，激活STAT3-BNIP3调节细胞自噬促进VZV复制[16,17].本试验通过分析湖羊感染伪狂犬病毒的肾脏转录组数据，发现了与已知伪狂犬病毒诱导的自噬不同的通路，即IL-6-STAT3-FOXO3-ATG8信号通路与PRV导致的细胞自噬可能存在关联.