基于生物信息学的糖尿病脑病关键基因与通路筛选及中药预测的研究

石崯力 王旭

摘要 目的：基于生物信息學方法对糖尿病脑病（DE）的关键基因进行初步筛选，探索与其相关的潜在靶点、生物过程及通路，进而预测治疗DE的潜在中药。方法：运用GEO数据库筛选出基因芯片原始数据集GSE161355作为样本进行研究。基于R Studio软件的质量评估和差异分析筛选差异基因，应用DAVID数据库进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，利用Cytoscape软件进行关键靶点筛选及关键功能模块构建、可视化。通过将关键靶点与Coremine Medical数据库相互映射，筛选治疗DE的潜在中药。结果：通过对GSE161355基因原始数据集的预处理，从DE患者中筛选出326个显著性差异基因，差异基因主要参与学习、记忆、神经元突触传递、细胞分裂、蛋白质分泌、血管生成调节等生物过程，与神经活性配体-受体信号通路、细胞周期通路等存在关联。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络显示MCHR2、CXCR2、GNAI1、P2RY13、NPY1R、C3、LPAR4、OXTR、CHRM5、CDC7、ORC5、ORC4、CCNA1可作为治疗DE的潜在靶点，多方位、多维度、多层面参与炎症反应、细胞凋亡、内质网应激、血管生成等生物过程。通过中药预测筛选发现人参、熟地黄、西红花、银杏叶、黄连、郁金等可作为潜在来源。结论：通过对显著性差异基因和潜在核心靶点的分析促进了对DE发病机制的进一步理解和探索，为今后治疗和评估提供了新的方向和临床依据。

关键词 生物信息学;糖尿病;脑病;糖尿病脑病;差异基因;作用机制;中医治疗;中药预测

Screening of Key Genes and Pathways Related to Diabetic Encephalopathy Based on Bioinformatics and Prediction of Effective Chinese Medicinals

SHI Yinli，WANG Xu

（The First School of Clinical Medicine of Nanjing University of Chinese Medicine，The Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China）

Abstract Objective：This study aims to screen key genes related to diabetic encephalopathy（DE），potential targets of the genes，and biological processes and pathways of the genes based on bioinformatics，and thereby predict potential effective Chinese medicinals.Methods：The microarray dataset GSE161355 was screened from Gene Expression Omnibus（GEO） for analysis.Differently expressed genes were yielded based on quality evaluation and difference analysis by R Studio，and DAVID was employed for Gene Ontology（GO） term enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analysis.Cytoscape was applied to screen key targets and visualize key functional modules.By mapping key targets with the Coremine Medical，we screened potential Chinese medicinals for the treatment of DE，and constructed the “potential medicinal-active component-core target” network.Results：A total of 326 significantly differential genes were screened out，which were involved in the biological processes such as learning，memory，synaptic transmission of neurons，cell division，protein secretion，and angiogenesis regulation，and the pathways of neural active ligand-receptor interaction，cell cycle，and other pathways.The protein-protein interaction（PPI） network showed MCHR2，CXCR2，GNAI1，P2RY13，NPY1R，C3，LPAR4，OXTR，CHRM5，CDC7，ORC5，ORC4，and CCNA1 were potential targets against DE，which were involved in inflammation，cell apoptosis，endoplasmic reticulum stress，angiogenesis，and other biological processes from multiple aspects.Radix Ginseng，Radix Rehmanniae Preparata，Stigma Croci，Folium Ginkgo，Rhizoma Coptidis，and Radix Curcumae were effective medicinals，which nourish qi，blood，yin and yang，promote blood circulation，remove blood stasis，dredge collaterals，resolve phlegm，refresh the brain，and resuscitate.Conclusion：This study further clarified the pathogenesis of DE through the analysis of differentially expressed genes and potential core targets，which provides a new theoretical research direction and clinical basis for future treatment and prognosis evaluation.75F30330-E95D-4C6C-AB27-FB800CFFDFFD

Keywords Bioinformatics; Diabetes Mellitus; Encephalopathy; Diabetic encephalopathy; Differentially expressed genes; Mechanism; TCM treatment; Chinese medicinal prediction

中图分类号：R285;R587文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.004

糖尿病脑病（Diabetic Encephalopathy，DE）是糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）常见的慢性并发症之一，是DeJong于1950年在一例严重的中枢神经系统异常的糖尿病患者病例中发现，并由此创造“糖尿病性脑病”这一概念[1]。一项对230万人的汇总分析发现，患有糖尿病的个体罹患痴呆的风险较正常个体要高出60%，且在女性中尤为显著[2]。现代研究认为，DE是患者处在长期高糖状态下导致中枢神经系统的正常生理结构和功能遭受破坏，神经电生理和影像学出现异常改变（如脑组织弥漫性改变、齿状核萎缩、软脑膜纤维化和血管病变）的一种神经系统并发症。患者出现不同程度的认知功能障碍包括学习、空间和记忆能力减退、健忘，严重者可进展至不可逆性癡呆，对患者的预后产生不良影响[3]。DE是多成分、多靶点、多通路作用形成的复杂的中枢神经系统疾病，目前尚无针对DE的西医诊疗方案，而中医通过辨证论治，认为DE以痰湿、瘀血、浊毒等侵犯机体，肾气亏损，气血运行不足，髓海空虚，神机失用为发病的基本病机，其病位在脑，与脾、肾多脏腑密切相关。越来越多的证据表明，中医药可通过调控神经细胞炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、内质网应激等多个生理病理环节进而起到治疗DE的作用[4-6]，但其具有未知性、复杂性的特点，使得中医药治疗DE的药理效应及机制的具体阐述仍有欠缺。生物信息学是将生物学、计算机信息学、网络技术等多学科交叉融合的一门综合学科[7]，将生物信息学应用于中医药领域，已成为现代研究的主流趋势。通过生物信息学方法对GEO数据库中的原始芯片数据进行初步筛选与分析，挖掘引起DE发病的关键基因，并对关键基因的潜在生物过程与信号通路进行分析，通过关键基因对具有潜在作用效应的中药进行预测，旨在揭示其复杂分子作用机制并为其进一步研究与临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据集获取

以“diabetic encephalopathy”作为检索词，将种属设置为“human sapiens”，在GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[8]中进行检索。检索后可获得12个数据集，对其数据集的内容进行再次规范化筛选后，以数据集GSE161355表达谱芯片作为最终研究样本，下载该基因表达谱芯片的表达矩阵与相关信息。

1.2 数据预处理

运用R Studio软件安装“Bioconductor”[9]“affyPLM”[10]“affy”“limma”[11]“pheatmap”和“ggplot2”[12]等相关扩展包。调用“Bioconductor”“affyPLM”“affy”包对GSE161355表达谱芯片进行包括质量控制、汇总探针集数据、计算基因表达数据、拟合回归的分析，绘制芯片相对对数表达（Relative Log Expression，RLE）箱线图、相对标准差（Normalized Unscaled Standard Errors，NUSE）箱线图。RLE为一个探针组在某个样品的表达值除以该探针组在所有样品中表达值的中位数后取对数，反映了平行实验的一致性。NUSE为一个探针组在某个样品的PM值的标准差除以探针值在各样品中的PM标准差的中位数，相较于RLE更为敏感，通过质量评估给予剔除降解严重的不可靠样本;利用“affy”[13]包读取经过质量控制处理后GSE161355的表达谱芯片数据，应用稳健多芯片平均标准化分析方法（Robust Mulitichip Average，RMA）对正常组样本和DE组样本进行处理后合并;运用最近邻居法（K-nearest Neighbor，KNN）寻找原始数据的缺失值并对其进行补充;运用GPL570芯片平台将Probe ID转换为Gene Symbol，获取经预处理后的标准化基因表达值。

1.3 差异表达基因筛选

基于R Studio软件中的“limma”包对标准化后的GSE161355芯片表达谱进行差异分析，通过采用贝叶斯方法进行多重检验矫正，以|log2 FC|>1，P<0.05作为显著差异基因的筛选条件。将筛选后的结果通过“pheatmap”“ggplot2”包进行可视化处理，以火山图和热图的形式输出。

1.4 差异基因的潜在代谢通路与生物过程分析

将获得的显著性差异基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）导入DAVID 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）[14]，将“Gene List”及“Background”设置为“homo sapiens”。基于R Studio软件的“ggplot2”扩展包进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，设定阈值P<0.05;下载“dplyr”“org.Hs.eg.db”安装包，以阈值P<0.05进行关键基因基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析，最终以条形图和气泡图的形式输出结果。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络构建 将获得的显著性差异基因导入String数据库（https：//string-db.org/cgi/input.pl），选择种属为“homo sapiens”，筛选条件为“minimum required interaction score>0.9”，将得到的PPI关系导入Cytoscape 3.8.0软件构建成分靶点和疾病靶点PPI网络[15]，通过Degree值分析各靶点在PPI网络中的重要程度[16];并通过分子复合检测（Molecular Complex Detection，MCODE）插件对构建的PPI网络进行模块挖掘，筛选出其中关联性强的PPI模块[17]。参数设置为：degree=3，node score=0.2，k-core=2，max.Depth=100。75F30330-E95D-4C6C-AB27-FB800CFFDFFD

1.6 关键靶点对接及中药预测

将筛选出的DEGs与DE相关的生物学过程导入Coremine Medical数据库（https：//www.coremine.com/）[18]中，设置阈值条件为P<0.05，由此筛选出与关键基因和潜在生物学过程相关的中药。从中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[19]中根据阈值口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18筛选预测中药的潜在化学成分，并运用Uniprot数据库对获得的有效靶点进行去重、规范化，将处理后的数据导入Cytoscape 3.8.0软件中构建“中药-有效成分-靶点”网络图，利用Cytoscape软件中Hubba插件[20]的MCC≥3为筛选标准对排列前20的靶点进行筛选并进行可视化处理。

1.7 差异基因表达谱芯片的一般情况 该GSE161355表达谱芯片数据集来源于英国谢菲尔德大学神经病学观察组，是由15例健康对照者与18例糖尿病患者的神经元、星形胶质细胞及神经血管内皮细胞组成。研究者将各组受试者的颞皮层细胞从体内提取出后在体外培养，通过免疫定向激光的方式捕获、显微切割、分离神经元、星形胶质细胞和内皮细胞。见表1。

2 结果

2.1 芯片数据质量评估

对GSE161355表达谱芯片的原始数据进行质量评估，得到RLE箱线图。结果提示，该数据集中各样本比值接近于1，对值接近于0，整体表达水平基本趋于一致。见图1。NUSE箱线图见图2，结果表明，除了GSM4905229和GSM4905233样本，其余31个样本的基因表达标准差基本趋于一致，由此说明GSM4905229和GSM4905233这2个样本质量较差，在后续的研究中应予以剔除。应用RMA法预处理及汇总剔除较差样本后的数据，将芯片上的Probe ID转化为Gene Symbol，并对数据集中存在缺失值的部分采用KNN法进行补充，最终汇总获取20 461个基因表達水平数据。

2.2 差异基因筛选结果

通过将糖尿病组样本与对照组进行比较，以P<0.05，|log2 FC|>1作为显著差异基因的筛选条件，应用R Studio软件进行分析，共筛选出326个DEGs，其中包含了309个表达上调基因及17个表达下调基因，表明正常个体与DE患者之间存在显著差异性基因。所选数据集的火山图和热图见图3～4。

2.3 关键靶点的代谢通路与生物过程分析

将获得的DEGs利用DAVID数据库进行GO分析，结果可获得30条GO富集功能，其中生物过程（Biological Process，BP）相关的条目最多，共18条，4条细胞组分（Cellular Component，CC）和8条分子功能（Molecular Function，MF）。以P<0.05为筛选条件选取GO条目，其涉及学习、记忆、神经元突触传递、细胞分裂、蛋白质分泌、血管生成调节等生物学过程。运用R Studio软件下的“ggplot2”扩展包对上述的分析结果进行可视化处理。见图5。利用DAVID数据库对DEGs进行KEGG通路分析，共获得6条富集通路，以P<0.05为筛选条件选取共4条KEGG条目。分析结果提示核心靶点与神经活性配体-受体相互作用信号通路、细胞周期通路等有关，与此同时还与病毒感染性疾病、寄生虫病、药物使用等存在联系。运用R Studio软件下的“ggplot2”扩展包对上述的分析结果进行可视化处理。见图6。

2.4 PPI网络的构建与分析

利用String数据库分别获得DEGs之间的互作网络，设置minimum required interaction score为highest confidence（0.9），将分析结果的TSV数据通过Cytoscape 3.8.0软件中进行可视化，该PPI网络中具有共有节点36个，43条边，平均Degree值为2.38;运用CytoNCA插件以Degree值大于中位数为标准进行筛选出核心靶点13个：MCHR2、CXCR2、GNAI1、P2RY13、NPY1R、C3、LPAR4、OXTR、CHRM5、CDC7、ORC5、ORC4、CCNA1;基于MCODE插件对PPI网络中的关联性较强的模块进行筛选，所得功能模块最大者由6个节点，15条边组成，score为6.0，该模块即为PPI网络中紧密联系的区域。见图7。

2.5 DE相关潜在核心靶点与生物学过程的中药预测

通过Coremine Medical数据库预测具有潜在治疗DE的中药，以P<0.05作为筛选标准，预测结果显示多种中药与NPY1R、LPAR4、OXTR、ORC5、DRD1、CDKN1A等核心靶点以及学习、记忆、细胞黏附、蛋白质水解等生物学过程关系较为密切。见表2。其中，人参、熟地黄等有补气补血之效，银杏叶、西红花等为活血化瘀通络之药，白果取化痰开窍、补肾滋阴之功，黄连、积雪草清热燥湿发挥降低血糖的作用，因此挑选上述中药进行有效成分与靶点的验证，构建“中药-有效成分-靶点”作用网络。见图8。基于MCC算法应用Cytoscape软件中的Hubba插件对前20的靶点进行筛选。其中颜色的深浅代表MCC评分的高低程度。结果表明人参、黄连、白果、银杏叶等中药的某些有效成分如槲皮素、山柰酚、豆甾醇、异鼠李素可通干预胰岛素作用、炎症反应、氧化应激等多条信号通路起到治疗DE的作用。见图9。

3 讨论75F30330-E95D-4C6C-AB27-FB800CFFDFFD

DE是属获得性认知行为缺陷为特征的DM慢性并发症之一，是由遗传、肥胖、饮食、情绪、外部环境多种因素共同作用引起。DE的发病与糖脂代谢紊乱、胰岛素作用异常、细胞凋亡、炎症反应、过度氧化应激以及Tau蛋白异常磷酸化密切关联[21]。利用生物信息学技术挖掘DE相关的基因表达谱，探索DE发生发展的潜在靶点与通路，寻求有效的干预中药，为临床研究提供了新的思路。

3.1 胰岛素抵抗参与了DE的发生 胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）是DM和代谢综合征发病的关键病理机制。长期的高糖环境使得胰岛B细胞对葡萄糖的摄取利用率下降，脑内胰岛素信号转导出现异常，进而破坏神经递质系统，引起细胞凋亡，加速β淀粉样蛋白（Amyloid Protein，Aβ）在脑内异常堆积，影响了发挥认知功能的主要部位大脑组织海马区神经元的形态与突触的可塑性，最终导致患者出现认知功能缺失。海马星形胶质细胞可因高血糖而造成损伤，改变谷氨酸能神经递质传递和糖酵解途径，抑制神经元-星形胶质细胞之间的能量代谢偶联，导致细胞受到兴奋性毒性影响，加速神经元的损伤与衰老[22-23]。通过对基因谱进行筛选发现，DEGs主要富集于胰岛素抵抗、趋化因子释放、炎症反应、细胞凋亡等方面。黑色素浓集激素受体2（Melanin-concentrating Hormone Receptor 2，MCHR2）是一种存在于灵长类动物脑组织的受体，其高表达可增加肥胖与代谢紊乱的发病风险，调控MCHR2可激活黑色素浓集激素，由此调节下丘脑的能量消耗使机体的能量代谢平衡处于稳态[24]。实验研究发现调控1型神经肽Y受体（Neuropeptide Y Receptor Type 1，NPY1R）的表达可抑制DM大鼠胰岛B细胞过度分泌，改善IR，延缓认知和记忆功能衰退[25]。溶血磷脂酸受体4（Lysophosphatidic Acid Receptor4，LPAR4）作为LPA的受体亚族之一，可有选择性地激活脂肪细胞，与Gα12/13蛋白产生偶联，重塑脂肪组织架构而抑制IR[26]。KEGG分析结果表明，神经活性配体-受体相互作用信号通路在改善IR、保护受损的神经元方面起到了积极的作用。多巴胺D1受体（Dopamine D1 Receptor，DRD1）作为中枢神经系统重要的神经递质，被认为与认知障碍的发生有关[27]。在胆碱能神经元广泛分布的大脑区域，缩宫素受体（Oxytocin Receptor，OXTR）过表达，对改善IR、平衡能量代谢、削弱负面情绪等方面起到一定的作用[28]，可作为治疗DE的潜在靶点之一。

3.2 细胞凋亡和炎症反应是DE进展的重要环节  IR不仅可以引起机体糖脂代谢紊乱，可促进细胞凋亡和炎症反应发生，影响着脑内神经系统的结构完整，阻碍神经系统功能的正常发挥，导致一系列神经系统疾病的发生。海马区IR的发生促使了星形胶质细胞的激化与激活，加速趋化因子、炎症介质的释放，加重炎症反应。应用MCODE方法对PPI网络中连接紧密的潜在靶点进行提取，获得了CHRM5、IL1B、CXCR2、C3、CDKN1A、HSPB1、ILF2等涉及炎症反应、细胞凋亡的重要基因。CXCR2可与相应的趋化因子配体IL-8、CXCL2、CXCL3结合激活，驱动中性粒细胞、单核细胞、上皮细胞和巨噬细胞，其过表达可导致db/db小鼠加剧炎症反应和糖脂代谢紊乱[29]。同时，C-X-C基序趋化因子受体2（C-X-C Motif Chemokine Receptor 2，CXCR2）通过核因子κB和PI3K-AKT等炎症信号通路出现异位表达，诱发细胞出现过早衰老[30]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（Cyclin-dependent Kinase-inhibitor 1，CDKN1A）是细胞周期調节的重要蛋白之一，通过转录合成相关蛋白以调控在细胞的增殖、分化、衰老和凋亡。有研究表明，CDKN1A与2型糖尿病的发病存在密切的关系，其作用机制可能与延缓过度炎症反应、调节血管生成和通透性相关[31]。

3.3 预测的中药可能是治疗DE的靶向药物 中医医家认为DE病程日久，或因痰蒙神窍，或因瘀血阻络，或因痰瘀毒互结，均会耗损阴阳，肾精不足，髓海空虚，故多表现健忘、精神恍惚、认知减退等。将预测出的潜在中药进行分类。1）补益药：人参、熟地黄、蜂蜜。2）活血化瘀通络药：白果、西红花、银杏叶、姜黄、郁金、肉桂、紫堇。3）清热祛湿，化痰开窍药：黄连、远志、积雪草、玉米须，各方药互相配伍，起化脑络瘀阻，调气血通畅，补正气虚损，调脾胃运化功能，固护肾气根本。实验研究表明人参的主要有效成分人参皂苷能干预糖脂代谢紊乱、抑制炎症反应和IR，通过胰岛素信号通路改善海马区Aβ的异常堆积，延缓认知障碍进展[32]。小檗碱作为黄连的有效成分，不仅可以通过下调晚期糖基化终末产物/晚期糖基化终末产物受体/核因子κB炎症信号通路，减少神经炎症反应，保护神经元，保护认知缺陷[33];还可调节高脂高糖引起的肠道菌群紊乱，改善IR，对机体内的长期高血糖环境起到缓解作用[34]。银杏叶提取物可减弱Aβ的异常沉积和tau蛋白的异常磷酸化，激活海马区星形胶质细胞自噬，降低肿瘤坏死因子、白细胞介素-1β等炎症介质的产生[35]。白果有效成分白果内酯对海马神经元的增殖与突触产生起到正向保护作用[36]。

本研究运用生物信息学方法对数据集GSE161355表达谱芯片进行处理与分析，结果表明DE的发生可能与神经元突触传导、胰岛素抵抗、细胞增殖、凋亡、炎症反应的相关机制关联，这些潜在靶点可能是干预DE进展的重要因素;预测的中药及其活性成分可作为治疗DE的新药物。但是研究仍有存在基因表达谱芯片的样本量有限、样本质量不均一、分析存在偏倚误差等不足，预测中药对DE的治疗效果还有待后续的临床及基础实验加以验证。

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（2021-04-13收稿 本文編辑：杨觉雄）

基金项目：国家自然科学基金项目（81973796）——“糖脂清”调控lncRNA-PVT1介导miR-106b/ATG16L/LC3通路改善糖尿病认知障碍的作用机制研究作者简介：石崯力（1995.11—），女，硕士，医师，研究方向：内分泌与代谢疾病方向，E-mail：viviennne@foxmail.com通信作者：王旭（1960.10—），女，博士，教授，主任医师，博士研究生导师，研究方向：内分泌与代谢疾病方向，E-mail：njzywangxu@126.com75F30330-E95D-4C6C-AB27-FB800CFFDFFD