正交试验在建立碰碰香组织培养快繁体系中的应用

向 丹，张缘源，喻 娜，赵 静

（广安职业技术学院，四川广安 638000）

碰碰香目前采用传统的扦插方式进行繁殖[4]，该方法繁殖速度慢，易发生变异，不利于保持碰碰香的优良性状。现代生物学技术中的植物组织培养技术具备繁殖速度快、保存亲本的优良性状的特点。然而，目前关于碰碰香组织培养快繁技术的研究很少。因此，本研究通过正交试验法对碰碰香的组织培养体系建立进行了研究，探讨不定芽诱导、组培苗生根培养的最适条件，为建立完善的碰碰香组织培养快速繁殖体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选取野外自然生长健壮植株的幼嫩茎段作为外植体，去除叶片后，用洗衣粉洗净茎段表面，在自来水下流水冲洗30min，吸水纸吸干茎段表面水分，用0.1%的HgCl2水溶液消毒5min，无菌水冲洗5 次，将茎段切成1.5cm 左右的长度，置于超净台盛有无菌水的无菌瓶中备用。

1.2 方法

1.2.1 不定芽诱导培养。采用L9（34）正交设计探究不同培养基种类、6-BA、2,4-D对碰碰香不定芽诱导的影响（见表1），每瓶接种外植体4 个，每种处理接种20 瓶，重复3 次。30d 后观察不定芽诱导情况，统计发芽数，计算诱导率。

表1 不定芽诱导培养正交试验L9（34）因素和水平

1.2.2 组培苗生根培养。采用L9（34）正交设计探究不同培养基种类、NAA、活性炭对组培苗生根的影响（见表2），每瓶接种组培苗4 个，每个处理接种20 瓶，重复3次。30d 后观察组培苗生根情况，统计生根苗数，计算生根率。

表2 组培苗生根培养正交试验L9（34）因素和水平

1.3 培养条件

以1/2MS、MS、WPM 为基本培养基，均添加琼脂6g/L，蔗糖30g/L，pH 调至5.8，高压蒸汽灭菌锅设置121℃、131kPa 灭菌20min。接种后的培养瓶置于组培室内，设置培养温度（25±2）℃，光照强度2500Lx，光照时间12h/d。

1.4 数据处理与分析

试验数据在Excel 软件上进行初处理后，用SPSS26.0 软件进行分析。

不定芽诱导率（%）=诱导出芽的外植体数目/接种的外植体数目×100

组培苗生根率（%）=生根的组培苗数目/接种的组培苗数目×100

2 结果与分析

2.1 碰碰香不定芽诱导培养基组合的筛选

由表3 可知，以MS 作为培养基进行碰碰香不定芽诱导的效果最好，诱导效果依次为MS＞1/2MS＞WPM，3 种培养基作用存在极显著差异（p＜0.01）。6-BA 浓度对碰碰香不定芽诱导的影响作用表现为1.0mg/L 6-BA＞1.5mg/L 6-BA＞0.5mg/L 6-BA，不同浓度间存在极显著差异（p＜0.01），以6-BA 1.0mg/L 最宜，浓度过高会抑制不定芽的诱导。2,4-D 浓度对碰碰香不定芽诱导率的影响效果表现为0.3 mg/L 2,4-D＞0.1mg/L 2,4-D＞0.2mg/L 2,4-D，以0.3mg/L 为最佳，不同浓度存在显著差异（p＜0.05）。

由表3 极差分析可知，培养基种类、6-BA 浓度、2,4-D浓度3 个因素的极差值大小为A＞B＞C，表明培养基种类是对不定芽诱导影响最大的因素，2,4-D浓度是对不定芽诱导的影响最小的因素，与方差分析的结果一致（表4），即碰碰香不定芽诱导率影响的作用依次为培养基种类＞6-BA 浓度＞2,4-D浓度。其中，A、B 因素在第2 水平对应的k 值均大于第1、3 水平的k 值，C 因素在第3 水平对应的k 值大于第1、2 水平的k 值，故碰碰香不定芽诱导培养基的最优组合为A2B2C3，即MS+1.0mg/L 6-BA+0.3mg/L 2,4-D。

表3 不同因素对碰碰香不定芽诱导影响的极差分析

表4 不同因素对碰碰香不定芽诱导影响的方差分析

为验证正交试验结果，配制最优组合培养基A2B2C3开展验证试验，接种20 瓶，碰碰香不定芽诱导率为92.5%，高于正交试验中的9 种培养基组合的诱导率，说明正交试验结果较好，碰碰香不定芽诱导的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3mg/L 2,4-D。

2.2 碰碰香组培苗生根培养基组合的筛选

由表5 可知，生根影响效果依次为1/2MS＞MS＞WPM，3 种培养基作用存在极显著差异（p＜0.01），以1/2MS 作为培养基进行碰碰香组培苗生根的效果最好。NAA 浓度对碰碰香组培苗生根影响作用表现为1.5mg/L NAA ＞1.0mg/L NAA ＞0.5mg/L NAA，以1.5mg/L 最佳。活性炭对碰碰香生根率的影响效果表现为3.0g/L 活性炭＞1.0g/L 活性炭＞5.0g/L 活性炭，以3g/L 最佳。

由表5 极差分析可知，培养基种类、NAA 浓度、活性炭浓度3 个因素的极差值大小为A＞B＞C，表明培养基种类是对碰碰香组培苗生根影响最大的因素，活性炭浓度是对组培苗生根影响最小的因素，与方差分析结果一致（表6），即碰碰香生根率影响的效果依次为培养基种类＞NAA 浓度＞活性炭浓度。A 因素在第1 水平对应的k 值大于第2、3 水平的k 值，B 因素在第3 水平对应的k 值大于第1、2 水平的k 值，C 因素在第2 水平对应的k 值大于第1、3 水平的k 值，故碰碰香组培苗生根培养基的最优组合为A1B3C2，即1/2MS+1.5mg/L NAA+3.0g/L 活性炭。

表5 不同因素对碰碰香组培苗生根影响的极差分析

表6 不同因素对碰碰香组培苗生根影响的方差分析

为验证A1B3C2为最优生根培养基组合，配制20瓶生根培养基开展验证试验，碰碰香组培苗的生根率高达98.8%，高于正交试验中的9 种培养基组合的生根率，说明正交试验结果较好，碰碰香组培苗生根的最佳培养基组合为1/2MS+1.5mg/L NAA+3.0g/L 活性炭。

3 结论与讨论

正交设计试验是建立植物组织培养快速繁殖体系的常见方法，可从多个因素和水平中选出代表性强的试验方案，通过统计分析，筛选出最优试验方案，省时省力。基于正交试验设计，通过极差分析和方差分析，对碰碰香组织培养体系中的不定芽诱导、组培苗生根的主要影响因素进行比较，筛选出碰碰香组织培养体系过程的适宜培养条件。影响碰碰香不定芽诱导率的主要因素有培养基种类、6-BA 浓度、2,4-D浓度，经过试验分析，筛选出不定芽诱导的最优培养基组合为MS+1.0mg/L 6-BA+0.3mg/L 2,4-D，在此培养条件下，不定芽萌发速度快，存活率高，叶片舒展较快，植株长势良好。对碰碰香组培苗生根的主要影响因素有培养基种类、NAA 浓度、活性炭浓度，经过统计分析，筛选出碰碰香组培苗生根最优培养基组合为1/2MS+1.5mg/L NAA+3.0g/L 活性炭，在此培养条件下，组培苗生根速度快，根系粗壮，叶色鲜绿，植株长势良好。

现有对碰碰香的组织培养研究很少，不定芽诱导最优培养基组合结果与张娜[5]的研究中的MS 培养基、1.0 mg/L 6-BA 结果一致。这可能是因为MS 培养基相对于1/2MS 和WPM 培养基的无机盐含量高，更利于不定芽的萌发和生长。同时，在基础培养基中需加入适当浓度的植物生长激素如6-BA、2,4-D才有利于组培苗的生长和发育，激素在一定浓度范围内有利于不定芽的诱导，超过一定浓度后会抑制不定芽的诱导。

组培苗生根最优培养基组合结果与张娜[5]的研究中的1/2MS 培养基结果一致，可能是因为1/2MS 培养基中含较低浓度的无机盐，更有利于组培苗根系的生长。褐化是植物组织培养中的常见问题，所以在碰碰香的生根培养基中除了添加生长素以外，还加入了活性炭，因为一定浓度的活性炭可以抑制褐化作用[6]，但试验结果的抑制效果不明显，可能是由于活性炭在吸附有毒物质抑制褐化的同时，也会吸附营养物质，不利于组培苗的生长[7]，这一因素的影响还需进一步的研究。本试验研究的最适培养基组合在激素浓度方面与已有的研究报道[1]存在一定的差异，这可能与碰碰香植株的来源不同、基因型存在差异、植株体所处的发育状态不一致等有关。