补阳还五汤对缺血再灌注脑损伤大鼠内质网应激-自噬的影响

程一升 陶壮俊 王苹莉

[摘要] 目的 探討补阳还五汤治疗对缺血再灌注脑损伤大鼠内质网应激及自噬的影响。 方法 建立大鼠大脑中动脉闭塞模型（MCAO）后分为假手术组、模型组及治疗组，治疗组灌胃补阳还五汤浓煎剂，模型组和假手术组均灌胃生理盐水，连续灌胃7 d。给药7 d后，采用改良的Berderson行为学评分方法对大鼠进行评分观察神经功能损伤情况，氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色观察脑梗死面积，qPCR检测脑组织葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78 kD，GRP78）、蛋白激酶RNA样内质网激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，elF2α）、自噬相关基因12 （autophagy related gene 12，ATG12） mRNA表达情况，透射电镜检查脑组织梗死周边交界区自噬小体情况，HE染色观察脑组织病理损伤。 结果 模型组大鼠的脑组织损失部分塌陷，硬度差，呈苍白色;模型组和治疗组的Berderson行为学评分明显高于假手术组（P<0.01），治疗组明显低于模型组（P<0.01）;模型组脑梗死面积较治疗组明显增多（P<0.01）;与模型组比较，治疗组的GRP78、PERK、elF2α、ATG12 mRNA表达明显减少（P<0.05）;治疗组自噬小体数量较模型组明显减少;治疗组病理损伤较模型组明显减轻。 结论 补阳还五汤可以改善大鼠脑缺血再灌注脑损伤，其机制可能是通过调控内质网应激-自噬发挥作用。

[关键词] 缺血再灌注脑损伤;补阳还五汤;内质网应激;自噬

[中图分类号] R255.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）11-0034-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of Buyang Huanwu Decoction on endoplasmic reticulum stress and autophagy in rats with ischemia-reperfusion brain injury. Methods The rat model of middle cerebral artery occlusion （MCAO） was established and divided into sham operation group， model group， and treatment group. The treatment group was intragastrically administered with Buyang Huanwu concentrated decoction. The model group and sham operation group were intragastrically administered with normal saline. They were intragastrically administered for seven consecutive days. After seven days of the administration， the neurological impairment of rats was observed by the modified Berderson behavioral scoring method. The cerebral infarction area was observed by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining. The mRNA expression of glucose regulated protein 78 kD （GRP78）， protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase （PERK）， eukaryotic initiation factor 2α （elF2α）， and autophagy-related gene 12 （ATG12） in brain tissue was detected by qPCR. The autophagosomes at the peri-infarct junction of brain tissue were examined by transmission electron microscopy. The pathological damage of brain tissue was observed by HE staining. Results The brain tissue loss area of rats in the model group was collapsed with poor hardness and pale color. The Berderson behavioral score in the model group and the treatment group was significantly higher than that in the sham operation group（P<0.01）. And the Berderson behavioral score in the treatment group was significantly lower than that in the model group （P<0.01）. The cerebral infarction area in the model group was significantly higher than in the treatment group（P<0.01）. Compared with the model group， the expression of GRP78， PERK， elF2α， and ATG12 mRNA in the treatment group was significantly reduced（P<0.05）. The number of autophagosomes in the treatment group was significantly reduced; the pathological injury in the treatment group was significantly alleviated. Conclusion Buyang Huanwu Decoction can improve cerebral ischemia-reperfusion brain injury in rats， and the mechanism may be through the regulation of endoplasmic reticulum stress-autophagy.25FD6154-391F-4604-85A4-A6BA1E8ED898

[Key words] Ischemia-reperfusion brain injury; Buyang Huanwu Decoction; Endoplasmic reticulum stress; Autophagy

缺血性脑损伤是各种原因造成脑组织缺血、缺氧引发的神经功能缺损的常见急性脑血管疾病，是全世界成年人第二死因与第一致残原因[1]。缺血性脑损伤会导致患者的运动功能障碍和认知功能异常，严重影响患者的生活质量。而脑缺血再灌注后，脑组织损伤程度会出现迅速加剧的现象，从而进一步加重患者的病情，但再灌注是局灶性脑缺血恢复脑神经功能的基础，所以减轻再灌注损伤、保护脑组织神经元功能至关重要。有研究表明，缺血再灌注脑损伤与内质网应激诱导的自噬密切相关[2-4]。补阳还五汤最早见于清·王清任的《医林改错》，由黄芪、赤芍、当归尾、川芎、桃仁、红花、地龙7味中药组成，具有益气活血通络的作用。研究表明，补阳还五汤对缺血性脑损伤具有显著的改善作用[5-7]。但其具体机制尚不明确。因此，本研究在制备大鼠MCAO模型的基础上，研究补阳还五汤对内质网应激-自噬的影响及其改善缺血再灌注脑损伤的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～8周龄的SPF级SD大鼠30只，体重（230.3±27.2）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号SYXK（浙）2013-0184。于浙江中医药大学动物实验研究中心SPF级实验室喂养，室温18～23 ℃，湿度65%～70%，自由饮水、摄食。经动物伦理委员会批准[伦研批第（2021-HS2）]。

1.2 药物

补阳还五汤组方：黄芪120 g，当归6 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，红花3 g，地龙3 g，川芎3 g。上述药物煎煮2次，合并后浓缩成生药浓度为2 g/ml，4 ℃冰箱避光冷藏备用。

1.3 主要试剂及仪器

Trizon Reagent（批号：9109），TAKARA公司;荧光定量PCR试剂（批号：RR420A），TAKARA公司;伊红染色液（G1100），北京索莱宝科技有限公司;Scott蓝化液（G1865），北京索莱宝科技有限公司;MOG线栓（2838-A5），北京西浓科技有限公司;低温高速离心机（5424R），德国Eppendorf公司;LightCycler 96 SW 1.1型定量PCR仪（美国Roche公司）;药品冷藏柜（BYC-310，山东博科生物）;显微镜（BX43，OLYMPUS）;切片机（2235），德国Leica公司;透射电镜（H-7650），日本日立公司。

1.4 模型制备及分组给药

使用改良Longa线栓法[8]制备大鼠MCAO模型：SD大鼠术前禁食12 h，不禁水，经2.5%戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定，沿大鼠前正中线切开颈部皮肤，再沿左侧胸锁乳突肌内缘逐层分离，暴露颈总动脉、颈外动脉并结扎，将线栓插入颈外动脉，并经大脑中动脉进入大脑前动脉近端，插入深度平均约（18.5±0.5）mm，直至稍感阻力，表明线栓到达大脑前动脉，扎紧备线，固定线栓。缺血1 h后拔出线栓，大鼠麻醉苏醒后出现站立不稳及提尾时身体向一侧转圈等右侧肢体瘫痪表现，则判定为模型成功。假手术组仅暴露颈总动脉、颈外动脉，不做动脉结扎及插线处理。

将造模成功的SD大鼠随机分为治疗组和模型组，每组各10只。治疗组灌胃补阳还五汤浓煎剂，假手术组、模型组均灌胃生理盐水。灌胃剂量为1 ml/100 g，1次/d，缺血再灌注后1 h即予灌胃给药，连续灌胃7 d。

1.5 观察指标

1.5.1 Berderson评分  分4级。0分：大鼠提尾悬空，前肢未见行为缺陷;1分：大鼠提尾悬空，一侧前肢长时间屈曲;2分：大鼠置于垫子上，拖拽尾巴滑动无抵抗，伴前肢屈曲，大鼠自由活动时无转圈行为;3分：大鼠置于垫子上，拖拽尾巴滑动重度无抵抗，大鼠自由活动时持续向瘫痪侧转圈。末次给药后1 h进行测定，得分越高神经功能损伤越严重。

1.5.2 脑梗死面积检测  使用氯化三苯基四氮唑（TTC）检测大鼠脑梗死面积，大鼠完全麻醉后，心脏灌流20 ml生理盐水后取脑，保留小脑、脑干和嗅球部分，注意保持脑组织的完整性，置于-20℃约30 min，弃去小脑和嗅球部分，切片并放入2%TTC染液的密闭容器中，37 ℃避光孵育15 min，梗死区呈灰白色，非梗死区呈深红色。在放置4%多聚甲醛溶液中固定24 h，根据顺序正反面拍照。用Image Pro Plus 6.0进行分析，按下列公式计算出大鼠脑梗死的面积。脑梗死面积（%）=脑梗死面积/全脑面积×100%。

1.5.3 qPCR法检测大鼠脑组织GRP78、PERK、elF2α、ATG12 mRNA表达  用Trizol一步法抽提小鼠CD4+T细胞总RNA。引物序列如下：GRP78 F：5'- ACGCACTTGGAATGACCCTT -3'，GRP78 R：5'- AAC TGCATGGGTGACCTTCTT-3'，PERKF：5'-ACTCAGA TGGAACGAGTTAGGAC-3'，PERK R：5'-ATGAACTC AAGGAGCGGGAC-3'，elF2αF：5'-AAACAACACTGTC CTGGCAAC-3'，elF2α R：5'-AGGGACATAAACTGCG ACCTT-3'，ATG12F：GACTGTCCAAGCACTCATCG-3'，ATG12 R：5'-CATCACTGCCAAAACACTCATA-3'，β-actin F：5'-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3'，β-actin R：5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3'。反应条件：变性（95℃，30 s），退火（95℃，5 s），延伸（60℃，30 s），40个循环。每个样本设置3个复孔，取平均值为检测结果。以β-actin作为内参基因来标准化样品，以2^（-△△Ct）方法計算目的基因相对表达量。25FD6154-391F-4604-85A4-A6BA1E8ED898

1.5.4 透射电镜观察大鼠脑组织自噬小体变化  取小鼠新鲜脑组织，用2.5%戊二醛浸泡，脱水，包埋，固化，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜拍片观察各组大鼠脑组织自噬小体的变化。

1.5.5 脑组织病理观察  将大鼠脑组织用多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后逐步脱蜡脱水，HE染色，蒸馏水洗涤，封片，光镜下观察各组大鼠脑组织病理改变。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，组内采用配对t检验，组间采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠造模情况比较

模型组大鼠脑组织塌陷，硬度差，呈苍白色，且体积比假手术组略小，梗死部位呈萎缩状态，提示造模成功，治疗组大鼠相较于模型组大鼠脑组織塌陷明显减轻，硬度改善，呈淡红色。见图1。

2.2  三组大鼠Berderson行为学评分比较

与假手术组大鼠Berderson行为学评分比较，模型组和治疗组大鼠行为学评分明显升高（P<0.01），而与模型组比较，治疗组大鼠评分明显下降（P>0.01）。见表1。

2.3 三组大鼠脑梗死面积比较

与假手术组大鼠脑梗死面积比较，模型组和治疗组大鼠脑梗死面积明显增多（P<0.01），而与模型组比较，治疗组大鼠脑梗死面积明显减少（P>0.01）。见表2、图2。

2.4三组大鼠脑组织GRP78、PERK、elF2α、ATG12 mRNA表达情况比较

与假手术组比较，模型组和治疗组的GRP78、PERK、elF2α、ATG12的含量均升高 （P<0.05），与模型组比较，治疗组的GRP78、PERK、elF2α、ATG12含量明显减少（P<0.05）。见表3。

2.5 三组大鼠脑组织自噬小体变化比较

假手术组中的大鼠基本无自噬小体形成，模型组和治疗组中的大鼠均可见双层膜包裹的自噬小体，其电子密度较高，与模型组比较，治疗组大鼠自噬小体数量明显减少。见图3。

2.6  三组大鼠脑组织病理比较

假手术组大鼠脑组织细胞清晰完整，分布均匀。而模型组和治疗组大鼠部分细胞核紧密相邻，部分细胞核松散。与模型组比较，治疗组大鼠脑组织细胞较模型组分布均匀且细胞核较致密，提示治疗组大鼠脑组织病理损伤减轻。见封三图1。

3 讨论

缺血性脑卒中为临床最常见的脑血管疾病之一，具有较高的致残率和致死率。因此在临床救治中，常采取扩张血管、恢复血供和营养物质供给等策略，但在施行救治措施时往往造成脑缺血再灌注损伤，其发病过程与内质网应激-自噬密切相关[9-11]。自噬是细胞内重要的分解代谢途径，通过双膜结构包裹隔离并与溶酶体融合，降解异常折叠的蛋白质及细胞组分，清除破坏的细胞器，“回收”氨基酸、核苷酸等物质供给细胞进行能量循环利用，是维持细胞内稳态的重要手段之一[12-13]。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指当细胞的内环境稳态遭到破坏时，蛋白质无法正确进行合成及折叠修饰，此时细胞通过一系列的适应途径对内质网功能紊乱作出快速反应，具有维持内质网的内稳态作用，因此适度的ERS可起到保护细胞的作用[14]。但持续的ERS会导致内质网功能紊乱，细胞就会激活细胞自噬诱导细胞凋亡。内质网通过未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）的激活以保护由内质网应激反应所引起的细胞损伤，恢复细胞功能[15]。GRP78是内质网应激发生、发展的最重要的标志因子，是内质网腔内的分子伴侣，被认为是ERS最敏感的标志物，可以折叠内质网内的蛋白质，并通过结合内质网内的Ca2+，发挥维持内质网稳态的作用[16]。在内质网应激时，GRP78与未折叠蛋白结合，将UPR信号从内质网传导到细胞质和细胞核[17]。PERK作为一种典型的UPR信号通路内质网应激传感器，在非应激状态时，PERK二聚体位点被GRP78遮盖，当应激状态时，GRP78可与PERK发生解离，PERK形成寡聚体，激活自身磷酸化，活化的PERK可特异性地磷酸化eIF2α，而磷酸化的eIF2α可促进编码转录因子ATG12表达，促进自噬体的成熟[18-19]。ATG12是自噬体形成的关键基因，参与自噬体前体形成，其表达水平可反映自噬程度[20]。

补阳还五汤是清代名医王清任的经典名方，主要用于缺血性脑卒中及其后遗症的治疗。补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤的脑保护作用在以往文献中报道较多，对其保护机制的研究亦有较多报道[21]，但其对内质网应激和自噬的影响的研究则相对较少，故本研究首先采用经典的线栓法制作脑缺血再灌注损伤模型，通过行为学评分、脑梗死面积及脑组织HE染色发现模型大鼠出现明显神经功能损伤及脑组织损伤，而应用补阳还五汤后上述变化均得到明显逆转，这与过往研究相符合。PCR结果也显示补阳还五汤可下调GRP78、PERK、elF2α、ATG12等内质网应激-自噬相关基因的表达。且本研究通过透射电镜观察各组自噬体，结果发现补阳还五汤可显著减少大鼠缺血侧脑组织自噬体的形成。

综上所述，补阳还五汤改善脑缺血再灌注损伤的机制可能是通过调节内质网应激-自噬发挥作用。

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（收稿日期：2021-04-19）25FD6154-391F-4604-85A4-A6BA1E8ED898