营养素干预对癫痫小鼠的发作及行为学影响

金伊楠 丁虹

關键词：癫痫，营养素干预，白杨素，行为学

【中图分类号】  R742.1【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2022）16--03

癫痫病（EP）是全世界最常见的慢性疾病之一，是一种发作性、致残性的脑功能障碍性疾病，影响数千万人[1]，表现为反复发作的慢性脑部疾病，患者的发作形式多样，可能会突然间毫无缘由的发作，可表现为抽搐、痉挛、昏厥、两眼发直等临床症状，具有发作性、短暂性、重复性和刻板性的特征。患者的正常生活和身心健康都因癫痫发作的不可控而受到极大的损害，其影响不仅停留在患者本人，更是波及其家庭，尤其对于目前很多婴幼儿患者及其家属而言，遭受着难以想象的压力。EP的发病原因复杂多样，往往是多种因素综合造成的结果，包括基因、创伤性脑损伤、中枢系统感染、脑血管疾病以及与认知功能损伤相关的退行性神经疾病[1]。对于婴幼儿患者而言，EP使得其神经发育异常，认知功能、运动能力均无法正常发育;对于成人患者，EP使得他们的生活质量下降，同时在心理方面承受着来自社会、家庭等各方面的压力，加之其可能诱发的焦虑或抑郁状态，使患者的正常生活工作都收到极大影响。有研究表明，EP与精神疾病相关联，可能增加患者患上精神疾病的可能，使患者寿命缩短[2]。目前常用的治疗药物包括苯妥英钠、奥卡西平、托吡酯等，也可以通过手术治疗进行神经刺激、切断等方式，由于患者可能出现的精神问题，可以适当辅以心理治疗。然而，许多患者可能在疾病的发展过程中出现耐药，而面临治疗瓶颈，仍需要不断开发寻找安全有效的新药。本研究通过营养素干预的方式来筛选研究几种营养素对癫痫小鼠的疾病发展的控制作用，以及对小鼠精神状态的影响。

材料

1.试剂和药物

2实验动物

取8-12周清洁级健康成年雄性昆明小鼠共100只，体重18～22g，购自武汉大学实验动物中心。喂养环境：饲养在12小时光亮/黑暗环境中，室内恒温22～25℃，分笼饲养，自由摄食及进水。实验前1周小鼠适应实验室环境。所有实验动物的管理均参照中华人民共和国科学技术部颁布的实验动物管理条例法（1988，No.134）执行。

方法

1.造模

模型：癫痫模型

Day1-day11腹腔注射PTZ（37mg/kg）制备慢性癫痫模型，day12腹腔注射PTZ（45mg/kg），后连续1h观察各组小鼠癫痫发作情况，并记录发作的等级、持续时间、潜伏期及死亡情况。

2.动物分组及药物干预

将60只小鼠随机分为正常组，PTZ组，PTZ+白杨素组，PTZ+蜂胶组，PTZ+梅芹茶组，PTZ+NMN组，PTZ+芹菜素组，PTZ+柚皮素组，PTZ+金合欢素组，PTZ+胞二磷胆碱片组。

（1）♂正常对照组：每日腹腔注射0.9%NaCl（0.1ml/10g），每日灌胃蒸馏水（0.1ml/10g），共计42天。（2）♂PTZ组：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃蒸馏水（0.1ml/10g），共计42天。（3）♂PTZ+白杨素组：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃白杨素50mg/kg（0.1ml/10g）。共计42天。（4）♂PTZ+梅芹茶组：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃梅芹茶2.5g/kg（0.1ml/10g）。共计42天。（5）♂PTZ+蜂胶组：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃蜂胶100mg/kg（0.1ml/10g）。共计42天。（6）♂PTZ+NMN组：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃NMN 90mg/kg（0.1ml/10g）。共计42天。（7）♂PTZ+芹菜素组：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃芹菜素20mg/kg（0.1ml/10g）。共计42天。（8）♂PTZ+柚皮素组：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃柚皮素20mg/kg（0.1ml/10g）。共计42天。（9）♂PTZ+金合欢素组：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃金合欢素20mg/kg（0.1ml/10g）。共计42天。（10）♂PTZ+胞二磷胆碱组：每日腹腔注射PTZ 37mg/kg。每日灌胃胞二磷胆碱30mg/kg（0.1ml/10g）。共计42天。

3.观察指标

营养素干预对小鼠行为学功能的影响

以往研究结果表明，PTZ诱导癫痫小鼠表现出一系列行为障碍，包括运动功能障碍和抑郁样行为。本研究通过各种行为学测试，包括旷场实验、悬尾实验、强迫游泳实验，对动物行为进行评价和分析。为保证每只小鼠在同一条件下进行测试，每只小鼠参与各个行为学实验的顺序保持不变。行为学测试的实施遵循双盲的原则，由不清楚各组小鼠分组及药物干预情况的测试者进行试验。

（1）小鼠痫性发作行为学评定

小鼠痫性发作等级评分

每次PTZ腹腔注射后，观察60min小鼠的行为学变化，参照Racine分级标准，记录痫性发作等级。本实验采取Racine（1972）行为学分级法对小鼠癫痫发作的严重程度进行分级。（见表1）

全面性强直-阵挛发作和极小阵挛性发作的潜伏期

每次PTZ腹腔注射后，参照Racine分级标准，观察大鼠出现的从轻度肌阵挛性抽搐发作到面部和前肢阵挛，没有失去扶正反射的连续痫性发作的间歇期为极小阵挛发作潜伏期。而出现平衡跌倒，全身强直-阵挛大发作的间歇期为全面性强直-阵挛发作潜伏期。

（2）旷场实验

将待观察小鼠置于内壁黑色的无顶盒子中，其规格为50cm×50cm×30cm，盒子底部被图像采集系统划分为25个正方形小格，小鼠应从正中央的小格放入，开始实验，记录5min内活动总路程、中央区（四周无墙壁的小格）滞留时间、静止不动时间、直立次数、大小便次数。

（3）悬尾实验

悬尾实验（TST）是通过无法克服不正常体位而诱导产生抑郁绝望行为，属于“干型”行为绝望模型。其原理是小鼠被悬尾后，会在本能的驱使下尝试逃脱，但由于外力无法逃脱，进而会放弃挣扎进入特有的抑郁不动状态，实验过程中记录动物不动时间来反映抑郁状态。将实验动物的尾部进行固定，使其头部悬挂朝下，动物在该环境中挣扎，企图摆脱该困境，在经过努力仍无法摆脱后，出现间断性不动，显示“行为绝望”状态。动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱，从而提供了一个无可回避的压迫环境，一段时间的实验后，记录处于该环境的动物产生绝望的不动状态过程中的一系列参数，动物的表现出的这种典型的“不动状态”，反映了一种被称之为“行为绝望状态”，记录处于该环境的动物产生绝望的不动状态过程中的一系列参数。实验中，我们将小鼠的尾部固定悬挂开始计时6min，记录6min内其悬尾不动的时间与挣扎攀爬的次数来反应其精神状态。

（4）强迫游泳实验

强迫游泳实验（FST）系统适用于大鼠、小鼠或其他实验室动物，通过将实验动物置于一个局限的环境中（如水中），与TST相似，一段时间的实验后，动物即表现出“不动状态”，反映出“行为绝望状态”，记录处于该环境的动物产生绝望的不动状态过程中的一系列参数。实验中我们将小鼠放入水中后立刻开始计时8min，通过记录后6min内小鼠漂浮不动的时间来反应小鼠的精神状态。

结果与讨论

实验对小鼠进行11周的培养，并定期记录每只小鼠的癫痫发作情况，最后计算平均得到每组小鼠的发作情况。实验中应用了白杨素、蜂胶、梅芹茶、中浓度NMN、芹菜素、柚皮素、金合欢素和胞二磷胆碱进行干预。

1.癫痫发作情况变化

通过统计结果（见图1.2）比较可以发现，与模型组比较，不同营养素中部分对癫痫的控制有一定的效果。实验结果显示，白杨素、中浓度NMN、柚皮素、金合欢素和胞二磷胆碱都有一定的效果。而其余营养素的干预效果较差。白杨素整体效果较好，在前期逐渐显现出对癫痫发作的控制，随着时间的推移，与模型组相比也有效抑制了癲痫的进程;蜂胶在前四周表现较好，然而之后癫痫发作的进展并未得到控制，甚至高于正常组的发作等级;梅芹茶在前期有一定的控制效果，但最终与模型组相差无异，认为无效;中浓度的NMN始终表现出良好的抑制作用，有效控制了癫痫的发作等级在1级到2级之间;芹菜素比蜂胶效果稍好，其控制效果在前六周表现良好，然而在之后并不能维持其干预作用;柚皮素在第11周将癫痫控制在1级左右，最终效果最优，实验培养过程中存在时有控制效果下降的问题，但整体干预作用较好;金合欢素在后期表现较好，有效控制并维持其干预效果;使用胞二磷胆碱与模型组相比，始终维持了较好的控制干预效果，期间也并没有太大的波动。

2.小鼠行为学变化

（1）旷场实验结果

在旷场实验中，对小鼠的抑郁情况进行评估，所得结果与癫痫发作的干预结果略有出入。（见图3）从实验结果可知，模型组的水平得分与总得分均高于正常组，说明癫痫小鼠较正常小鼠更为焦虑。白杨素、蜂胶、柚皮素和金合欢素干预的小组其水平得分与总得分均比模型组低，更接近正常组，说明这几种营养素的干预对癫痫小鼠的精神状态有较好的干预效果。梅芹茶、中浓度NMN和芹菜素干预组的小鼠与模型组相比水平得分与总得分有所下降，但高于正常组，表明其对癫痫小鼠的焦虑状态有所改善，但最终效果并不及上述的其他几种干预。胞二磷胆碱的干预对癫痫小鼠的焦虑状态并没有明显的改善。各组小鼠的粪便粒数与正常组相差无几，对焦虑状态的反映不够直观明显。就直立次数而言，正常组与模型组在均值上差异不显著，但误差范围内正常组的直立次数更多，表明癫痫小鼠对外界的求知欲下降，有一定的抑郁倾向。白杨素、梅芹茶和中浓度NMN的干预组小鼠直立次数较模型组更高，说明三者能帮助小鼠减轻抑郁。其余营养素干预组的小鼠直立次数并没有显著提高，对小鼠抑郁倾向并没有明显改善。正常组的中央区停留时间叫模型组更长，表明癫痫小鼠可能有焦虑倾向。白杨素与金合欢素干扰组的中央滞留时间显著下降，表明这两种营养素对小鼠的焦虑状态可能有较好的缓解作用，其他营养素的干预作用并不明显。

（2）悬尾实验结果

从悬尾实验结果来看（见图4），正常组的悬尾不动时间与攀爬次数都高于模型组，需要进一步实验重复验证其准确性。结果显示，所有的营养素干预对癫痫小鼠的求生欲并无提高，对抑郁状态也没有明显改善，各组的悬尾不动时间与攀爬次数与模型组相比无改善。

（3）强迫游泳实验结果

在强迫游泳实验中，正常组的不动时间高于模型组，有待进一步重复验证。根据结果分析（见图4），白杨素干预组和梅芹茶干预组均表现出较强的求生欲，表明其精神状态较好;中浓度NMN干预组和胞二磷胆碱干预组的时间与模型组相差不大，说明其对癫痫小鼠的抑郁状态改善不大。其余组别与正常组相比没有太大差异，与模型组相比也没有更多的改善。

3.讨论

实验通过PTZ致毒性进行癫痫小鼠的造模，利用黄酮类营养素干预来比较其有效性，进一步探讨其可能的机制。通过对小鼠11周的培养记录，可以发现白杨素、中浓度NMN、柚皮素、金合欢素和胞二磷胆碱能够改善癫痫的发作，相较于其他营养素，它们的有效性更持久;通过旷场实验可以得知，使用白杨素、蜂胶、柚皮素和金合欢素干预的癫痫小鼠在抗焦虑方面具有较好的表现，而白杨素、梅芹茶和中浓度NMN的干预组的癫痫小鼠在求知欲方面表现优于模型组，表明其抑郁倾向得到缓解;在悬尾实验中，各营养素的表现相差无几;在强迫游泳实验中，白杨素干预组和梅芹茶干预组的小鼠表现出更强的求生欲。因此，结合所有实验的结果来看，在所有营养素中，白杨素在各方面的表现最佳，它能有效改善癫痫的发作，同时对癫痫小鼠的精神状态也起到了很大的帮助作用。白杨素为5，7-二羟基黄酮，具有抗肿瘤、抗焦虑、抗炎、抗氧化等药理活性，它能够通过上调Nrf2-ARE信号通路相关蛋白进而激活大鼠体内抗氧化酶系和自由基清除系来减轻这些物质对大鼠脑组织造成的损伤，另外，白杨素也可能通过上调p-ERK、同时下调NF-κB和p-P38的表达发挥神经保护的作用[3]。除此之外，有关于脑缺血-再灌注损伤的实验表明，白杨素可通过上调神经营养因子NGF、BDNF表达量而对脑缺血-再灌注损伤具有一定的神经保护作用。有研究[4]证明，白杨素可改善创伤性脑损伤（TBI）大鼠前庭运动功能障碍，改善认知记忆障碍，减轻焦虑/抑郁样行为，其可能的机制是通过调节大脑皮质和海马DG区Bcl-2家族蛋白的表达来减轻神经炎症和预防神经元凋亡。对于PTZ致毒性的癫痫小鼠而言，白杨素可能发挥神经保护作用，同时减轻PTZ引发的脑内炎症，进而对抗PTZ诱发的癫痫的发展。另一方面，白杨素具有抗抑郁/减轻焦虑的作用，对于癫痫诱发的焦虑和抑郁有一定的缓解作用。通过研究实验我们可以发现，部分营养素对癫痫的进展具有一定的控制作用，同时也能缓解其带来的精神方面的不良影响。通过营养素进行干预是极具潜力的方向，药物治疗可能会带来许多不良反应，而营养素能够避免对人体造成伤害，同时与药物配合治疗可能会达到更好的治疗效果，或许营养素干预的方案能够阻止一些患者病程发展为难治性癫痫，对于患者及其家庭而言都具有重大意义。对于无论是白杨素，还是实验涉及到的其他营养素，需要进一步重复实验以及其他实验辅以验证来确定它们的干预效果。

事实上，目前癫痫普遍存在于我们的生活中，在婴幼儿中的发病率也极高，对于许多家庭而言，面对新生命诞生的愉悦被疾病打破，家人承受着巨大的经济与心理负担。而对营养素干预作用的研究或许将给这些家人带来希望，通过营养素干预使得患者有机会摆脱镇静剂，走向新生活。因此对于营养素干预控制癫痫病程发展的深入研究与筛选具有重要意义。

参考文献：

[1]张萌，王兰桂.癫痫发病机制的研究进展[J].中西医结合心血管病电子杂志，2020，8（35）：31-32.

[2]马慧萍，吴金华，蒙萍，等.白杨素对大鼠急慢性脑缺血损伤后氧化应激和Nrf2/HO-1途径的影响[J].解放军医药杂志，2015，27（12）：15-20..

[3]赵煦萌.白杨素对实验性脑梗死大鼠脑保护作用及其机制的研究[D].河北：河北医科大学，2013.DOI：10.7666/d.Y2337622.

[4]王叶叶，江羽，梁晨，等.白杨素对脑缺血-再灌注损伤的神经保护机制研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2019，21（4）：580-586.