超声波结合酶法提取艾叶总生物碱工艺优化及其抑菌活性

陈 阳，廖子蔚，陶娟娟，江 丹，孙代华,2，陈志元,

（1.劲牌持正堂药业有限公司，湖北黄石 435000；2.湖北省中药配方颗粒工程技术研究中心，湖北黄石 435000）

艾叶（Artemisia argyileaves）又名艾蒿、家艾，气味清香、味苦，广泛分布于我国的湖北、河南、安徽等地[1-3]。在我国南方，艾叶常被作为食物原料制作艾叶粽、艾叶馒头、艾叶饼干等功能性食品[4]。目前，对艾叶的应用主要集中于其黄酮类成分、多糖、艾叶精油上，而对艾叶中生物碱利用的报道较少[5-7]。有研究表明生物碱化合物具有较为显著的降血糖、抗肿瘤、保护神经系统、治疗炎症、治疗心脑血管疾病等作用，具有较高的经济价值[8-10]。

传统提取生物碱的方法主要有冷凝回流法、有机溶剂提取法、超声提取法，但都提取时间较长或得率不高[11]。近年来，已有报道证明超声波结合酶法提取生物碱具有较高的研究前景[12]。生物酶解技术可以在极短的时间内将植物细胞壁分解，促使内部天然产物活性成分流出，极大地提高了目标成分的提取率[13-15]。超声波技术利用超声波与介质的机械摩擦、空化、解聚、放热等作用，使天然产物在溶剂中瞬间产生的空穴崩解，细胞破碎，从而缩短了胞内外的物质交换时间[16-17]。因此，与传统的生物碱提取方法相比，超声波结合酶法提取生物碱具有耗时时间短、提取量高等优势[12]。

目前，仅有使用有机溶剂提取法对艾叶中总生物碱进行提取的研究，但提取方式较为单一、有效成分提取量较低且功能活性尚不明确[18]。本课题组尚未发现有超声波结合酶法提取艾叶中总生物碱及其抑菌活性的相关研究报道。因此，对超声波结合酶法提取艾叶中总生物碱的工艺进行优化并研究其抑菌活性是非常有意义的。本实验以单因素实验和Plackett-Burman试验筛选出对艾叶总生物碱提取量影响较大的因素，再利用Box-Behnken试验对超声波结合酶法提取艾叶中总生物碱的工艺进行优化研究，以获得提取艾叶中总生物碱的最佳工艺条件，并运用纸片法和稀释法测定艾叶总生物碱提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性，为艾叶中总生物碱的工业化生产和艾叶资源的综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

艾叶 湖北省桐罗堂中药材有限公司，经湖北师范大学张新潮副教授鉴定为菊科植物艾A. argyiLevl. et Vant.的干燥叶；盐酸小檗碱 标准品HPLC≥98%，中国食品药品检定研究院；纤维素酶（酶活力≥50000 U/g，327T011）、果胶酶（酶活力≥50 U/g，335A022） 索莱宝科技有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）美国MicroBiologics公司；庆大霉素 上海吉至生化科技有限公司。

TU-1901紫外可见分光光度计 北京普析通用有限公司；AB135-S分析天平 梅特勒-托利多公司；恒温培养箱 上海深信实验仪器有限公司；Synergy H1多功能酶标仪 美国Biotek公司；触摸式超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 艾叶总生物碱提取工艺 精确称取50 g艾叶（过60目筛）和0.75 g复合酶（纤维素酶:果胶酶=1:1），加入到5倍体积的纯净水中，混匀，升温至50 ℃，用稀盐酸调节pH至5.0，水浴酶解2 h，在酶解过程中每隔10 min测量溶液pH，并根据测定结果使用稀盐酸调节溶液pH，保持溶液pH稳定，酶解结束后升温溶液至95 ℃灭活复合酶，然后使用95%乙醇和纯净水将溶剂调整为25倍量的70%乙醇溶液，超声（140 W，55 ℃）40 min，过滤，摇匀，即得艾叶总生物碱提取液样品。

1.2.2 单因素实验 精确称取50 g艾叶（过60目筛），参考冀德富等[12]的方法并根据预实验的结果设定酶解温度50 ℃，复合酶添加量2%（纤维素酶:果胶酶=1:1），料液比1:25 g/mL，酶解pH5.0，酶解时间2 h，乙醇浓度70%，超声温度55 ℃，超声功率140 W，超声时间30 min为艾叶总生物碱单因素实验过程中的常规变量。以超声时间（20、30、40、50、60 min）、复合酶添加量（0%、1%、2%、3%、4%）、料液比（1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL）、酶解时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、超声功率（120、140、160、180、200 W）、酶解pH（4、5、6、7、8）、乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）、超声温度（50、55、60、65、70 ℃）8个变量代替单因素实验中的相应常规变量，研究各因素对艾叶总生物碱提取量的影响。

1.2.3 Plackett-Burman试验筛选关键因素 依据单因素实验的结果，以艾叶总生物碱的提取量为响应值，对料液比、复合酶添加量、酶解时间、酶解pH、超声时间、超声功率、乙醇浓度、超声温度8个变量进行筛选，每个单因素选取低水平（-1）和高水平（1）两个水平，共计12组实验。Plackett-Burman试验因素及水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman试验因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental

1.2.4 Box-Behnken试验优化艾叶总生物碱提取工艺 根据Plackett-Burman试验结果，选取超声时间（A）、复合酶添加量（B）和酶解时间（C）为自变量，设定艾叶总生物碱的提取量为响应值，进行三因素三水平响应面优化试验，实验设计表如表2所示。

表2 响应面试验设计因素与水平Table 2 Design factors and level of response surface methodology

1.2.5 艾叶总生物碱提取量测定 参考李杰等[18]的方法，精密称取12.5 mg盐酸小檗碱对照品（105 ℃干燥至恒重）溶解至终浓度为0.25 mg/mL。分别吸取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，以硫酸定容后在350 nm吸光度下检测样品的吸光度A值。以盐酸小檗碱的质量浓度为横坐标，测得的吸光度A值为纵坐标，得到标准曲线A=0.0698C+0.0602，R2=0.9981。使用建立盐酸小檗碱标准曲线的方法，测定艾叶总生物碱提取液样品的吸光度A值，并根据A值计算出样品中艾叶总生物碱的浓度[19]。艾叶总生物碱的提取量按照公式（1）计算：

式中：Y为艾叶总生物碱提取量，mg/g；C为根据盐酸小檗碱标准曲线计算得到的艾叶总生物碱的质量浓度，μg/mL；V为艾叶总生物碱定容后的体积，mL；M为实验使用的艾叶样品质量，g。

1.2.6 培养基的配制 抑菌实验选用LB固体培养基和液体培养基，LB液体培养基配方：胰蛋白胨5.0 g、酵母粉2.5 g、氯化钠5.0 g、去离子水500 mL，LB固体培养基在液体培养基的基础上再加入2.5%的琼脂粉，121 ℃灭菌20 min。

1.2.7 菌悬液的制备 分别将各供试菌种接种于LB固体培养基上，37 ℃恒温培养18 h后，使用无菌接种针挑取少许活化后的单菌落接种于LB液体培养基中，然后继续37 ℃恒温培养8 h后，使用无菌生理盐水稀释制备出含菌1×106～1×107CFU/mL的菌悬液[20]。

1.2.8 纸片法测定艾叶总生物碱抑菌圈直径 用加样枪移取30 μL经活化的菌悬液于LB固体培养基上，用L型玻璃涂布棒涂布均匀。向6 mm药敏纸片上分别加10 μL无菌提取物溶液（总生物碱浓度分别为1.6、3.2、6.4 mg/mL），将药敏纸片贴于平板表面。以无菌水做阴性对照，以庆大霉素作为阳性对照。将涂布有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的LB固体培养基平板置于37 ℃恒温培养箱中培养16 h。所有实验设置3个平行实验组，测定各抑菌圈的直径[21]。

1.2.9 最低抑菌浓度（MIC）测定 采用两倍稀释法测定艾叶总生物碱的最低抑菌浓度，将艾叶总生物碱梯度稀释为0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/mL，分别精确吸取1 mL各梯度稀释液于无菌试管中，再在各个试管中加入1 mL LB液体培养基和100 μL菌悬液，对照组中使用1 mL无菌水代替艾叶总生物碱稀释液，37 ℃条件下恒温培养24 h。以试管澄清状态的稀释液浓度为最低抑菌浓度[22]。

1.3 数据处理

本实验使用软件SPSS20.0进行显著性分析，以Origin8.6作图，采用Design-Expert V8.0.6软件进行Plackett-Burman试验和Box-Behnken试验设计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声时间对艾叶总生物碱提取量的影响 从图1A可以看出，当超声时间为40 min时，艾叶总生物碱的提取量达到最高值，随着超声时间延长其提取量逐渐降低。这可能是由于当超声时间为40 min时，艾叶细胞壁破坏度最高，酶促反应过程较为彻底。但是随着超声时间延长，艾叶总生物碱会被超声波的热效应、剪切效应以及空穴效应分解，从而导致艾叶总生物碱的提取量降低[23]。因此，超声时间应在30～50 min较为合理。

2.1.2 复合酶添加量对艾叶总生物碱提取量的影响由图1B可知，艾叶总生物碱的提取量随着复合酶添加量的增加呈现先升高后降低的趋势，并在2%时达到最高值。当酶浓度在适宜的范围内时，随着酶浓度的升高，酶与底物相互碰撞接触的机会开始加剧，酶对艾叶细胞壁的酶解速率加快，从而使胞内总生物碱溶出率增加。当酶浓度过高时，由于酶存在竞争性抑制作用，反而降低了细胞壁的酶解度，导致胞内溶出物减少[24]。考虑到酶的价格问题，因此复合酶添加量应在1%～3%较为合理。

图 1 超声时间（A）、复合酶添加量（B）、料液比（C）、酶解时间（D）、超声功率（E）、酶解pH（F）、乙醇浓度（G）以及超声温度（H）对艾叶总生物碱提取量的影响Fig.1 Effects of ultrasonic time (A), compound enzyme addition amount (B), solid to liquid ratio (C), enzymolysis time (D), ultrasonic Power (E), enzymatic pH (F), ethanol concentration (G) and ultrasonic temperature (H) on yield of total alkaloids from Artemisia argyi leaves

2.1.3 料液比对艾叶总生物碱提取量的影响 由图1C可知，艾叶总生物碱的提取量随着料液比的升高呈现先升高后稳定的趋势。这是因为随着料液比的增加，溶剂进入细胞壁的速率加快，从而利于溶剂将胞内物质带出，然而当料液比继续增加时，细胞转运通道达到饱和状态，并不能继续提高艾叶总生物碱的提取量。考虑到生产耗能问题，因此料液比应在1:20～1:30 g/mL较为合理。

2.1.4 酶解时间对艾叶总生物碱提取量的影响 从图1D中可以看出，艾叶总生物碱的提取量随着酶解时间的增加先升高后降低，在酶解时间为1.5 h时达到最大值，这与Meng等[25]的研究结果一致。因此，酶解时间在1～2 h较为合理。

2.1.5 超声功率对艾叶总生物碱提取量的影响 由图1E可知，艾叶总生物碱的提取量随着超声功率的提高呈现先升高后降低的趋势。这是因为随着超声功率的增加，细胞壁被破坏程度逐渐提高，胞内物质溶出的更加彻底。但超声功率过高时会造成过热现象，从而分解胞内目标物质[26]。因此，选择超声功率为140～180 W较为适宜。

2.1.6 酶解pH对艾叶总生物碱提取量的影响 由图1F可知，当酶解pH为6时，艾叶总生物碱的提取量最高。这可能是因为复合酶在较为合适的pH范围内，酶活较高，过高或过低的反应pH均会影响酶与底物的结合，从而造成提取量下降[27]。因此，选择酶解pH为5～7较为适宜。

2.1.7 乙醇浓度对艾叶总生物碱提取量的影响 由图1G可知，乙醇浓度在50%～80%范围内，艾叶总生物碱的提取量逐渐升高，乙醇浓度为80%时，提取量达到最大值。当乙醇浓度高于80%时，提取量逐渐下降。这可能是由于随着乙醇浓度的增加，艾叶中的脂溶性成分溶出，这些脂溶性成分可能与乙醇-水分子相互结合，从而与艾叶中的生物碱形成竞争关系，导致艾叶总生物碱的提取量下降[28]。

2.1.8 超声温度对艾叶总生物碱提取量的影响 由图1H可知，在50～60 ℃，随着超声温度的升高，艾叶总生物碱的提取量提高，当超声温度高于60 ℃，艾叶总生物碱的提取量开始下降，可能是由于温度过高导致生物碱结构不稳定，部分生物碱被分解，从而引起艾叶总生物碱的提取量下降[29]。

2.2 关键因素分析

使用Minitab17软件对Plackett-Burman试验设计表（表3）中的各项数据进行多元回归方程分析，得到以艾叶总生物碱的提取量为响应值的回归方程为：Y=0.4793+0.0701A+0.0758B+0.0370C+0.0820D+0.0387E-0.0325F-0.0076G+0.0005H，同时得到各因素的效应评价情况，如表4所示。

表3 Plackett-Burman试验各因素设计及响应值Table 3 Design and response values of Plackett-Burman test

根据表4中效应值的大小可知，影响艾叶总生物碱提取量的各因素大小顺序为酶解时间（X4）＞复合酶添加量（X2）＞超声时间（X1）＞超声功率（X5）＞料液比（X3）＞超声温度（X8）＞乙醇浓度（X7）＞酶解pH（X6）[30]。根据P的大小可知，超声时间、复合酶添加量以及酶解时间对艾叶总生物碱提取量的影响具有显著性意义（P＜0.05），而料液比、超声功率、酶解pH、乙醇浓度和超声温度影响无显著性意义（P＞0.05）。因此选择超声时间、复合酶添加量和酶解时间这三个显著因素进行响应面优化分析。根据单因素实验的结果并考虑生产成本，固定料液比1:25 g/mL、超声功率160 W、酶解pH6.0、乙醇浓度80%和超声温度60 ℃。

表4 Plackett-Burman试验各因素效应评价Table 4 Effect evaluations of each factor under Plackett-Burman test design

2.3 Box-Benhnken试验优化分析

2.3.1 响应面多元回归方程的建立 采用Design-Expert V8.0.6软件对表5中的响应面数据进行多元回归方程拟合分析。得到两个因素之间交互作用对艾叶总生物碱提取量影响的等高线图和3D响应面图（图2），并得到以艾叶总生物碱的提取量为目标的回归方程模型公式为：Y=-0.67351+0.034709A+0.13931B+0.80485C+(3.17500E-004)AB+(1.31839E-017)AC-0.031700BC-(4.59625E-004)A2-0.031663B2-0.24715C2。

图 2 各因素交互作用对艾叶总生物碱提取量的影响Fig.2 Effects of various factors interactions on the yield of total alkaloids from Artemisia argyi leaves

表5 响应面优化方案及结果Table 5 Response surface optimization scheme and results

2.3.2 响应面方差分析 进一步对该模型进行方差分析以及显著性检验，结果如表6所示。

由表6可知，该回归方程模型P＜0.05且失拟项P=0.8463＞0.05，表明该多元回归方程模型的拟合度较高，用于优化艾叶总生物碱的提取量可靠性强[31]。另外，该模型的决定系数R2=0.9938且调整决定系数R2Adj=0.9859，说明通过该方程得到的优化实验结果相关性和真实性较强。因此，该模型可用于优化和预测艾叶总生物碱的提取量。表6中A、B、BC、A2、B2和C2对艾叶总生物碱提取量的影响具有显著性意义（P＜0.05），而C、AB、AC对艾叶总生物碱提取量的影响不具有显著性意义（P＞0.05）[32]。使用Design-Expert V8.0.6软件对该多元回归方程模型的最佳提取工艺进行预测，得出艾叶总生物碱提取的最佳条件为超声时间38.31 min，复合酶添加量1.63%，酶解时间1.52 h，在此基础上，预测艾叶总生物碱的提取量最高为0.718 mg/g。

表6 响应面回归方程模型方差分析Table 6 Analysis of variance of response surface regression equation model

2.3.3 艾叶总生物碱的最优提取条件验证结果 考虑到工业实际生产情况，并结合超声时间40 min、复合酶添加量1.60%、酶解时间1.5 h进行三次平行验证实验，得到艾叶总生物碱提取量的平均值为0.720±0.05 mg/g，与得到的预测值无显著性差异（P＞0.05）。李杰等[18]使用乙醇直接提取艾叶总生物碱，并利用BP神经网络结合遗传算法对其响应面数据进行建模，优化提取工艺后得到艾叶总生物碱的提取量为

0.3827 mg/g。本实验采用超声波结合酶法提取艾叶总生物碱将其提取量提高约188.14%。因此，超声波结合酶法提取艾叶总生物碱不仅具有较高的工业价值，而且拓宽了艾叶总生物碱的利用空间。

2.4 抑菌活性分析

2.4.1 艾叶总生物碱抑菌效果分析 图3是艾叶总生物碱提取液对大肠杆菌（Ⅰ）和金黄色葡萄球菌（Ⅱ）的抑菌作用效果图，其中ⅠA和ⅡB为20%庆大霉素抑菌圈，ⅠB和ⅡA为3.2 mg/mL的艾叶总生物碱抑菌圈。由图3和表7可知，艾叶总生物碱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较为明显的抑菌效果，且随着浓度的增加抑菌圈的直径逐渐变大。3.2 mg/mL的艾叶总生物碱对大肠杆菌的抑菌作用与20%庆大霉素抑菌作用效果相近；3.2 mg/mL的艾叶总生物碱对金黄色葡萄球菌的抑菌作用略强于20%庆大霉素抑菌作用效果。这说明艾叶总生物碱对不同的致病菌种类抑菌效果也不相同。总体来说，艾叶总生物碱具有抑菌效果。

图 3 艾叶总生物碱提取液对大肠杆菌（Ⅰ）和金黄色葡萄球菌（Ⅱ）的抑菌作用Fig.3 Antibacterial effect of the extract of total alkaloids from Artemisia argyi leaves on Escherichia coli (Ⅰ) and Staphylococcus aureus (Ⅱ)

表7 不同浓度艾叶总生物碱提取液的抑菌性Table 7 Antibacterial properties of extracts of total alkaloids from Artemisia argyi leaves at different concentrations

2.4.2 艾叶总生物碱最低抑菌浓度结果 由表8可以看出，艾叶总生物碱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为3.2、1.6 mg/mL。这表明艾叶总生物碱对金黄色葡萄球菌的抑菌活性高于大肠杆菌。

表8 艾叶总生物碱的最低抑菌浓度（MIC）Table 8 Minimum inhibitory concentration (MIC) of the total alkaloids from Artemisia argyi leaves

3 结论

本实验使用超声波结合酶法提取艾叶总生物碱，首先通过单因素实验得到各个因素的最佳范围条件，再使用Plackett-Burman法筛选出对艾叶总生物碱提取量影响较为显著的因素，最后利用Box-Behnken法对提取工艺进行优化分析，得出最佳的提取工艺条件为超声时间40 min，复合酶添加量1.60%，酶解时间1.5 h，料液比1:25 g/mL，酶解pH6.0，超声功率160 W，乙醇浓度80%，超声温度60 ℃，在此提取工艺条件下艾叶总生物碱的提取量为0.720±0.05 mg/g。另外，通过抑菌实验发现，艾叶总生物碱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌效果，且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果高于大肠杆菌。从实际应用方面分析，艾叶总生物碱提取物可能成为一种新型的抑菌原料去替代合成抗生素应用于生物、化学、饲料加工等领域。本实验为艾叶总生物碱的利用提供了参考依据，扩大了艾叶资源的利用范围。