箭叶淫羊藿提取物活性成分、抗氧化及酶抑制活性分析

王秦军，王翠萍，刘建欣，陈 琛,

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院/陕西省资源生物重点实验室/陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心/秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室（培育），陕西汉中 723000；2.汉中天然谷生物科技有限公司，陕西汉中 723000）

淫羊藿（Epimedium brevicornuMaxim.）是我国名贵滋补中药材之一，是保健食品原料之一，民间常用其根叶制作保健酒、保健茶及药膳等保健品[1]。淫羊藿始载于《神农本草经》，味辛、甘、温，主补肾阳、祛风湿。临床常用其治疗阳痿遗精、风湿及痉挛等病状[2-3]。临床上，淫羊藿在骨质疏松症、乳腺疾病及生殖系统疾病治疗方面有良好的疗效[4]。黄酮类化合物是淫羊藿主要的药理成分，主要有淫羊藿苷、淫羊藿素、朝藿定、淫羊藿次苷等[5]。化学研究表明，淫羊藿中分离出黄酮、多糖、精油、植物甾醇、酚酸和生物碱等260多种成分[6]。淫羊藿的多种成分，易受到产地、加工方式等多重因素影响，影响临床药效。药典记录的淫羊藿品种有朝鲜淫羊藿、心叶淫羊藿、巫山淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿。箭叶淫羊藿为淫羊藿属分布最广的品种，其最早被药典收录且被历版药典收载[7-9]。

现代生活方式的改变及人口老龄化使肥胖、糖尿病、高血压及阿尔茨海默症等发病率急速增加，中草药提取物能够预防或治疗以上疾病。脂肪酶抑制剂可以降低膳食脂肪的水解，降低人体吸收脂肪效率，以此缓解肥胖及高脂血症等症状。胆碱酯酶抑制剂可以抑制胆碱酯酶与乙/丁酰胆碱结合，从而调节老年痴呆患者的中枢神经胆碱功能；酪氨酸酶是已知唯一与黑色素合成相关的酶，与人类的色素障碍性疾病、黑色素瘤、白化病和老年痴呆等疾病的发生与治疗有直接关联[10-12]。淫羊藿的多种药理活性使其成为热点研究对象。谭莉等[13]和席晓志等[14]分别优化了淫羊藿叶多糖及淫羊藿的提取工艺，并对其抗氧化活性进行了评价；张运辉等[15]研究了淫羊藿治疗阿尔兹海默症的作用靶点及通路，明确了其作用机制；Wang等[16]的研究结果显示淫羊藿苷可作为治疗黑色素瘤辅助治疗剂；同时，Wang等[17]研究了去甲基淫羊藿苷对脂肪生成的影响及其体外潜在机制。前人对于淫羊藿的研究报道较多，但主要集中于对其提取物及黄酮类成分进行定量分析、体外抗氧化能力评价及体内作用机理探究，有关于淫羊藿对脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰/丁酰胆碱酯酶体外抑制未见相关报道。高通量体外评价具有简便、快速、高效的特点，广泛应用于天然产物活性成分的初步筛选，评价效果可作为开发膳食补充剂和功能性食品的参考[18]。通过研究并建立体外淫羊藿对脂肪酶、酪氨酸酶、胆碱酯酶抑制活性和抗氧化活性，为扩大淫羊藿的应用范围和综合开发利用提供基础数据。

因此，本实验测定了淫羊藿提取物中总多酚、总黄酮、总多糖、原花青素及淫羊藿苷、朝藿定A-C及宝藿苷I等含量；并通过对DPPH·、·OH、ABTS+·清除率评价了淫羊藿体外抗氧化活性；利用脂肪酶、酪氨酸酶及两种胆碱酯酶对淫羊藿体外酶抑制活性进行分析评价，为其综合开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

箭叶淫羊藿 产地四川广元，阴干，干品由汉中市天然谷生物科技股份有限公司提供；芦丁（≥95%）、原花青素（≥97%）、胰脂肪酶（400 U）、奥利司他（≥95%）、石杉碱甲（98%） 索莱宝公司；4-甲基伞形酮油酸酯 Sigma公司；左旋多巴（99%）、ACHE（500 U）、BCHE（500 U） 上海源叶生物有限公司；酪氨酸酶（2.5 kU）、曲酸（99%）、碘化乙酰胆碱（ATCI）、硫代丁酰碘化胆碱（BTCI） 阿拉丁公司；其他试剂均为分析级。

I-Series LC-2030高效液相色谱仪 株式会社岛津制作所；酶标仪 美国BioTek公司；ME104E电子天平 上海博特勒-托科多仪器有限公司；723型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 淫羊藿提取物制备 称取淫羊藿粉末，加入70%乙醇（料液比=1:7）回流提取3次，提取液过滤，HPD-100大孔树脂用95%乙醇浸泡24 h，用蒸馏水清洗至无醇味装柱，将提取液上样（上样量:树脂量=1:2），30 ℃下用70%乙醇以3 BV/h洗脱2 h，收集洗脱液[19]。真空干燥得到干燥的淫羊藿提取物，备用。取1000 mg冻干粉末，用蒸馏水定容至50 mL容量瓶中，超声30 min，10000 r/min离心5 min，收集上清液。

1.2.2 总多酚含量测定 参考Aktumsek等[20]的方法，反应体系稍作修改。取150 μL没食子酸溶液（0～100 μg/mL），分别加入450 μL蒸馏水和550 μL福林酚试剂，避光3 min，加入2.5 mL Na2CO3溶液，40 ℃水浴15 min，于760 nm处测定吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标曲，其标准方程为Y=0.0039X+0.0586，R2=0.9994。

1.2.3 总黄酮含量测定 参考Xi等[21]的方法，并略作修改。取100 μL芦丁溶液（0～100 μg/mL），加入50 μL 5% NaNO2反应6 min，加入50 μL 10%硝酸铝反应6 min，再加入1 mol/L氢氧化钠500 μL，避光10 min，于510 nm处测定其吸光度值，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为Y=0.0010X+0.0402，R2=0.9997。

1.2.4 多糖含量测定 参考陈琛等[22]的方法，并略作修改。取1 mL葡萄糖溶液（0～100 μg/mL），加入1 mL 6%苯酚和5 mL浓硫酸，混匀，静置10 min，30 ℃水浴10 min。于490 nm处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为Y=0.0031X+0.0905，R2=0.9995。

1.2.5 原花青素含量测定 参考石磊等[23]的方法，并稍作修改。取150 μL原花青素溶液（1～5 mg/mL），加入500 μL 5%香草醛溶液及10%盐酸混合液，30 ℃水浴15 min，于500 nm处测定吸光值，以原花青素浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标曲，其回归方程为Y=0.0456X+0.0413，R2=0.9991。

1.2.6 黄酮类成分含量测定 采用LC-2030高效液相色谱仪进行含量测定，色谱条件[24]：分析柱为Weich Xtimate® C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A：乙腈，流动相B：水。检测波长分别为270 nm，进样10 μL，流速0.7 mL/min，检测温度30 ℃。梯度洗脱条件：0～3 min，80% D；3～9 min，80%～70%D；9～25 min，70% D。每个样品平行三次。

1.2.7 抗氧化活性评价

1.2.7.1 清除DPPH·能力 参考Chen等[25]的方法，反应体系稍作修改。取50 μL不同浓度样液，加入150 μL DPPH（0.14 mg/mL）溶液，避光30 min。在517 nm处测定其吸光度。VC为阳性对照。根据以下等式计算自由基清除率（%）：

式中：Ai为样液组OD值；Ai0以等体积水代替DPPH溶液，测定所得吸光度为样液背景吸光度OD值；Aj用等体积水代替样品溶液测定吸光度所得OD值。

1.2.7.2 清除·OH能力 参照Zhao等[26]的方法，反应体系略作修改。取50 μL不同浓度样液，加入50 μL FeSO4（9 mmol/mL）及50 μL水杨酸-乙醇溶液（9 mmol/mL），再加入50 μL H2O2溶液（1.5 mg/mL），避光30 min，于510 nm处测定吸光度。以VC为阳性对照，清除率计算公式为：

式中：Ai为样液组OD值；Ai0用蒸馏水代替H2O2溶液，测定所得吸光度为样液背景吸光度OD值；Aj为空白组OD值，即用等体积水代替样品溶液测定的吸光度值。

1.2.7.3 清除ABTS+·能力 参考Rozi等[27]的方法，并稍作修改。取1.5 mL ABTS溶液（6 mmol/mL）与50 μL不同浓度样液混合，25 ℃下水浴40 min，在734 nm下测定吸光度。以VC为阳性对照。清除率计算公式如下：

式中：Ai为样液组OD值；Ai0以等体积水代替ABTS溶液，测定所得吸光度为样液背景吸光度OD值；Aj用等体积水代替样品溶液测定吸光度作为空白组OD值。

1.2.8 酶抑制活性评价

1.2.8.1 脂肪酶抑制活性 参考本实验室前期建立的方法[28]，反应体系略作修改。50 μL样液与50 μL脂肪酶液（1 U/mL）于96孔板中混合，然后加入100 μL 4-甲基伞形酮油酸

酯底物（0.75 mg/mL），37 ℃下水浴15 min。激发波长360 nm，检测波长465 nm下检测淫羊藿提取物溶液的荧光值，检测时间30 min。以Tris-HCl溶液替代样液检测荧光值作为空白组；Tris-HCl溶液代替酶液检测荧光值作为样液背景组，阳性对照为奥利司他。脂肪酶抑制率（%）计算公式如下：

式中：Ai为样液组吸光度；Ai0为样液背景吸光度，用Tris-HCl代替酶液测定吸光度；Aj以Tris-HCl代替样液作为空白对照吸光度。

1.2.8.2 酪氨酸酶抑制活性 参考袁晓擘等[29]的测定方法反应体系稍加修改。取80 μL样液与80 μL酪氨酸酶溶液（5 U/mL），加入100 μL PBS（pH=6.8）溶液混合，避光5 min，加入80 μL左旋多巴溶液（2.5 mg/mL），室温静置20 min。于475 nm波长处测定样品组吸光度值（Ai），以PBS缓冲液替代酶检测吸光度值（Ai0）用作样液背景组；以PBS缓冲液替代样液检测吸光度值（A0）用作空白组，曲酸溶液为阳性对照，酪氨酸酶抑制率计算公式如下：

式中：Ai为样液组吸光度；Ai0用PBS代替酶液测定吸光度，作为样液背景吸光度；用PBS代替样品测定吸光度作为空白对照吸光度。

1.2.8.3 胆碱酯酶抑制活性 参考Orhan等[30]的方法，体系稍作修改。将50 μL样液与125 μL 1.5 mmol/L DTNB溶液混合，加入50 μL酶液（0.25 U/mL）和75 μL PBS缓冲液（pH=8.0），室温避光10 min。于412 nm处测定样品组吸光度值（Ai），PBS缓冲液替代酶液检测吸光度值（Ai0）用作样液背景组；以PBS缓冲液替代样液吸光度值（A0）用作空白组，以石杉碱甲溶液为阳性对照，胆碱酯酶抑制率计算同式（2）。

式中：Ai为样液组吸光度；Ai0用PBS代替酶液测定吸光度，作为样液背景吸光度；用PBS代替样品测定吸光度作为空白对照吸光度。

1.3 数据处理

所有实验均重复3次以上，采用SPSS 22.0、Excel 2019、GraphPad Prism 9.00等软件分析和作图。

2 结果与分析

2.1 淫羊藿提取物的化学成分

4种标准曲线方程及淫羊藿提取物植物化学成分含量如表1所示，提取物中总多酚的含量最高，为105.60±0.92 mg/g；总黄酮次之，含量为70.09±0.75mg/g；原花青素含量较少，仅有8.79 mg/g；而总多糖含量达到18.45±1.27 mg/g。廖莉玲等[31]的研究报道淫羊藿中的总多酚及总黄酮含量分别为29.75及46.00 mg/g，均低于本实验中测定的总多酚与总黄酮含量；李倩等[32]测定的淫羊藿总黄酮含量58.2 mg/g，也低于本研究测得的总黄酮含量。付亮等[33]测定的淫羊藿总多糖高于本研究测定的总多糖含量，可能是因为淫羊藿产地、品种及提取方式等因素不同所导致。

表1 淫羊藿提取物植物化学成分分析Table 1 Analysis of phytochemical constituents in the extracts of Epimedium

2.2 黄酮类化合物含量

由表2可得，测定结果显示淫羊藿提取物中淫羊藿苷的含量最高，为266.16±4.22 mg/g；其次为朝藿定C，含量为43.35±0.67 mg/g；朝藿定A与朝藿定B含量相当；宝藿苷I含量最低，达到2.54±0.07 mg/g。淫羊藿5种黄酮类化合物含量HPLC结果见图1，可以看出，5种化合物在18 min时已得到完全分离，4号峰（淫羊藿苷）响应值及表面积远高于测定其他黄酮类化合物，表明淫羊藿中淫羊藿苷含量最大，与表2测定结果一致。党亚峰等[34]研究发现，朝藿定C在巫山淫羊藿中含量最高，为2.68 mg/g；淫羊藿苷含量次之，为0.10 mg/g，均低于本实验中二者的含量；同时，相较于张翔等[35]测定的超高压提取法淫羊藿苷含量最高，含量为137.25 μg/mg，低于本实验测定的淫羊藿苷含量，同时其测定的朝藿定C含量为49.33 μg/mg，与本实验测定的接近；在于雪娥等[36]报告中，10批次淫羊藿总黄酮胶囊中淫羊藿苷的含量在82.48～89.39 mg/g范围之间，相对于本实验所测含量较低。

表2 样品中5种黄酮类成分含量Table 2 Content results of five flavonoids

图 1 HPLC测定5种黄酮成分Fig.1 Five flavonoids were determined by HPLC

2.3 抗氧化活性

本实验从清除DPPH、OH、ABTS+自由基的三个方面评价淫羊藿苷的抗氧化活性，结果如图2所示。

淫羊藿苷具有自由基清除、抑制过氧化的能力[37-38]。由图2可知，淫羊藿提取物浓度升高，其对自由基清除能力也升高。由表3可知DPPH·清除能力的IC50=4.43±0.40 mg/mL，同时由图2a可知，当淫羊藿提取物浓度达到10 mg/mL时，其对DPPH自由基清除率达到82%，略低于VC的清除效率，表明淫羊藿提取物对DPPH·具有一定的清除能力；由图2b可知，淫羊藿提取物在浓度为2 mg/mL时，其对·OH清除率已超过40%，在4～12 mg/mL时，对·OH清除率趋近于一致，说明淫羊藿提取物在浓度达到4 mg/mL后对·OH清除能力较小，由表3得知，淫羊藿清除·OH的IC50=2.83±0.09 mg/mL，高于VC的IC50值，说明淫羊藿对于OH自由基有一定清除能力；由图2c可知，样品浓度对于ABTS+·清除能力影响较大，样品浓度在1 mg/mL时，其清除率为15%，而样液浓度达到4 mg/mL时，淫羊藿提取物对ABTS+·的清除率达到97%，接近于VC，其IC50=2.04 mg/mL。综上，淫羊藿提取物有一定的抗氧化能力。

表3 淫羊藿提取物清除DPPH、OH、ABTS+自由基的IC50值Table 3 IC50 value of Epimedium extract in scavenging DPPH,OH and ABTS+ free radicals

图 2 淫羊藿对DPPH、OH、ABTS+自由基的清除率Fig.2 Scavenging rates of Epimedium on DPPH, OH and ABTS+ free radicals

2.4 酶抑制活性

淫羊藿提取物对于4种酶的抑制活性水平结果如图3所示，4种酶的抑制率都随着淫羊藿提取物浓度的升高而增大。在脂肪酶评价中，提取物浓度达到10 mg/mL时，其抑制率达到91%，与奥利司他的抑制率接近，且由表4可知，提取物对脂肪酶抑制的IC50=5.97±0.04 mg/mL，表明淫羊藿提取物具有降脂的潜力；酪氨酸酶抑制的IC50=2.27±0.23 mg/mL，且当提取物浓度为1 mg/mL时，其抑制率已经达到43%，当提取物浓度为10 mg/mL时，其抑制率为88%，略低于曲酸的酶抑制率；在两种胆碱酯酶酶抑制评价中，提取物浓度为0.1 mg/mL时，ACHE的抑制率为20%，BCHE的酶抑制率仅有13%，当提取物浓度达到20 mg/mL时，ACHE抑制率为88%，BCHE的抑制率达到95%，与石杉碱甲相当。同时，通过表4可知，BCHE的IC50=7.41±0.26 mg/mL，ACHE的IC50=9.27±0.07 mg/mL，故提取物对于两种胆碱酯酶均有一定的抑制作用。

表4 淫羊藿提取物抑制脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰/丁酰胆碱酯的IC50值Table 4 IC50 values of Epimedium extract inhibiting lipase,tyrosinase and acetyl / butyrylcholine ester

图 3 淫羊藿提取物对脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰/丁酰胆碱酯酶抑制率Fig.3 Inhibitory rate of Epimedium extract on lipase, tyrosinase and acetyl/butyrylcholinesterase

3 结论

本文研究了淫羊藿提取物化学成分含量，并对淫羊藿苷、朝藿定A-C及宝霍苷I的含量进行了测定，在此基础上研究评价了淫羊藿体外清除自由基能力及对脂肪酶、酪氨酸酶及胆碱酯酶4种酶的酶抑制能力。结果发现，淫羊藿提取物中富含多酚及黄酮类化合物且淫羊藿苷含量丰富；提取物对于DPPH·及ABTS+·的清除率与阳性对照VC相当，这说明提取物具有较强的体外自由基清除能力；同时，对胰脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶4种酶抑制结果中，淫羊藿提取物的酶抑制率接近甚至超过了阳性对照，表明了提取物在体外也具有一定的酶抑制能力。综上表明，本研究为淫羊藿提取物体外生物活性研究提供了一些参考性数据，同时说明淫羊藿提取物可作为一种天然的抗氧化剂，亦可作为抗阿尔兹海默症、抗皮肤病及抗肥胖症的潜在资源，为淫羊藿的综合利用提供了依据。