Hp感染通过上调miR-192促进胃癌细胞增殖的机制研究

刘洪福　林森海　赵华丽　张蕾　余年发　曾翔辉　刘宇一　曾祥福

[摘要] 目的 探討miR-192与胃癌患者幽门螺旋杆菌（Hp）感染的关系并分析其对细胞增殖的影响及机制研究。方法 收集2019年7月至2021年4月赣南医学院第一附属医院收治的胃癌患者50例作为GC组，选取同期行胃镜检查的浅表性胃炎患者50例作为对照组。采用尿素酶法检测Hp感染，RT-PCR检测miR-192的表达，分析Hp+胃癌患者miR-192表达与胃癌临床病理特征的关系。在Hp+ MKN-45细胞中转染miR-192模拟物、miR-192抑制物及无关对照（NC），并将细胞分为Inhibitor组、Mimics组和NC组。MTT法检测细胞增殖，荧光素酶报告基因验证miR-192与P53基因的靶向关系，Western blot检测P53蛋白表达。结果 胃癌患者Hp+率（74.00% vs. 32.00%）显著高于对照组（P<0.01）。和对照组相比，胃癌组织miR-192表达显著升高，P53 mRNA表达显著降低（P<0.01）。GC组和对照组Hp+者miR-192表达水平显著高于Hp-者（P<0.05）。miR-192表达与Hp感染、淋巴转移和临床分期显著相关（P<0.05）。转染成功后，Inhibitor组细胞增殖活力降低（P<0.05），Mimics组细胞增殖活力升高（P<0.05）。荧光素酶报告分析确定P53是miR-192的下游靶基因，且Inhibitor组P53蛋白水平高于对照组和NC组（P<0.05）。结论 miR-192在胃癌患者中表达升高，其变化与Hp感染、淋巴转移和肿瘤分期有关。miR-192是一种促癌miRNA，通过靶向P53基因促进Hp+胃癌细胞增殖。

[关键词] 胃癌;幽门螺旋杆菌;miR-192;P53;增殖

[中图分类号] R735.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）14-0004-05

Study on mechanism of Hp infection promoting gastric cancer cell proliferation by up-regulating miR-192

LIU Hongfu1   LIN Senhai2    ZHAO Huali3   ZHANG Lei4   YU Nianfa1   ZENG Xianghui1   LIU Yuyi1   ZENG Xiangfu1

1.Department of Gastrointestinal Surgery， the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University， Ganzhou  341000， China; 2.Department of General Surgery， Yudu People′s Hospital in Jiangxi Province， Yudu  342300， China; 3.Department of Outpatient， the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University， Ganzhou  341000， China; 4.Department of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University， Ganzhou  341000， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between miR-192 and Helicobacter pylori （Hp） infection in gastric cancer patients， and to analyze its effect on cell proliferation and its mechanism. Methods A total of 50 patients with gastric cancer admitted to the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University from July 2019 to April 2021 were collected as the GC group， and 50 patients with superficial gastritis who underwent gastroscopy at the same period were selected as the control group. The Hp infection was detected by the urease method and miR-192 expression was detected by RT-PCR to analyze the relationship between miR-192 expression and clinicopathological features of gastric cancer in Hp+ gastric cancer patients. Hp+ MKN-45 cells were transfected with miR-192 mimics， miR-192 inhibitors， and normal controls （NC） and divided into Inhibitor group， Mimics group， and NC group. The cell proliferation was detected by the MTT assay; the targeting relationship between miR-192 and P53 gene was verified by the luciferase reporter gene; the expression of P53 protein was detected by the Western blot. Results The Hp+ rate of gastric cancer patients （74.00% vs. 32.00%） was significantly higher than that of the control group （P<0.01）. Compared with the control group， the expression of miR-192 was significantly increased and the expression of P53 mRNA was significantly decreased in the gastric cancer tissues （P<0.01）. In GC group and the control group， the expression levels of miR-192 in Hp+ patients were significantly higher than those in HP- patients （P<0.05）. The miR-192 expression was significantly correlated with Hp infection， lymphatic metastasis and clinical stage （P<0.05）. After transfection， the proliferation activity of cells in the Inhibitor group was decreased （P<0.05）， and that in the Mimics group was increased （P<0.05）. The luciferase report analysis confirmed that P53 was the downstream target gene of miR-192， and the protein level of P53 in the Inhibitor group was higher than those in the control group and the NC group （P<0.05）. Conclusion The miR-192 expression is elevated in gastric cancer patients， and its changes were related to Hp infection， lymphatic metastasis and tumor stage. The miR-192 is a cancer-promoting miRNA that promotes the proliferation of Hp+ gastric cancer cells by targeting P53 genes.117D23AB-06A7-412F-8A2B-D3B8AC70CA84

[Key words] Gastric cancer; Helicobacter pylori （Hp）; miR-192; P53; Proliferation

胃癌是常见的恶性肿瘤，我国每年新发胃癌近41万人，死亡约30万人，严重危害国民的生命健康[1]。目前，胃癌尚缺乏理想的肿瘤标志物，从而给其诊断、疗效评价、预后及康复等造成困难。microRNA（miR）是一类小的非编码RNA，通过转录后水平调控基因表达，参与各种生物过程[2-3]。研究发现，多种microRNAs在胃癌中异常表达[4-5]。幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）在胃炎到胃癌的演变中发挥重要作用，且与多种microRNA的异常表达相关[6]。miR-192参与多种肿瘤的发生，但其与胃癌相关的报道甚少。本研究旨在探讨miR-192在胃癌中的表达，并分析其与Hp的相关性及其促进胃癌细胞增殖的分子机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料

PCR仪购自Bio-Rad公司;RPMI-1640培养基购自Gibio公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司;细胞增殖和凋亡试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司;cDNA反转录试剂盒购自TaKaRa公司;Hp快速诊断试剂盒购自本溪斯特捷生物科技有限公司;P53、β-actin抗体购自Abcam公司;miR-192抑制物（inhibitor），miR-192模拟物（mimics）及无关对照（NC）引物由上海博锐生物科技公司设计合成;miR-192和β-actin引物由上海吉玛基因公司完成。

1.2 研究对象

收集2019年7月至2021年4月赣南医学院第一附属医院收治的胃癌患者50例作为GC组，所有患者均经病理确诊，排除合并其他肿瘤及经过放化疗者。其中男32例，女18例;平均年龄（67.69±5.38）岁。另选取同期行胃镜检查的浅表性胃炎患者50例作为对照组，采集其胃黏膜组织进行研究。其中男30例，女20例;平均年龄（68.21±5.72）岁。两组性别（χ²=0.170，P=0.680）、年龄（t=-0.101，P=0.920）比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经赣南医学院第一附属医院医学伦理委员会批准。

1.3 菌株和细胞

Hp菌株购自ATCC，人胃癌细胞系MKN-45购自协和细胞库。细胞常规培养于RPMI-1640培养基中，待密度至80%左右，以100∶1的倍数与Hp共培养。24 h后提取总RNA;将Hp+MKN-45细胞接种于6孔板转染miR-192 inhibitor、miR-192 mimics或miR-192 NC，将其分为Inhibitor组、Mimics组和NC组。

1.4 Hp感染检测

胃癌组织和对照组胃黏膜组织行快速尿素酶试验，具体操作方法参照试剂盒说明书，5 min内试剂由黄色变成红色，则为阳性。

1.5 细胞增殖

将转染后的各组细胞置于培养箱中培养，分别在培养12、24、36、48、72 h后，加入20 μl MTT溶液，继续培养4 h后，加入二甲基亚砜150 μl，酶标仪（490 nm）检测吸光度值，计算细胞增殖率。

1.6 RT-PCR

取-80°C保存的组织，液氮中研磨至粉末，Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，β-actin为内参，置于RT-PCR上进行扩增，引物序列见表1，2^-ΔΔCt法计算miR-192和P53 mRNA相对表达量。

1.7 荧光素酶报告基因检测

TargetScan软件预测miR-192与P53 3′-UTR结合序列，将其插入荧光素酶质粒上，构建野生型载体（P53-WT）。另外，构建P53 3′-UTR核苷酸突变的突变型载体（P53-MUT），将P53-WT、P53-MUT分别与miR-192 mimics、miR-192 NC共转染至Hp+ MKN-45细胞中，24 h后检测荧光素酶活性。

1.8 Western blot

采用Western blot法，以β-actin为内参，检测组织和细胞内P53蛋白相对表达量。

1.9 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析;計数资料以[n（%）]表示，组间采用χ²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hp感染情况

GC组胃癌患者中Hp+37例，阳性率为74.00%，对照组浅表性胃炎患者Hp+16例，阳性率为32.00%。GC组Hp+率显著高于对照组（χ²=17.704，P<0.01）。

2.2 组织中miR-192、P53 mRNA表达水平比较

RT-PCR结果显示，和对照组比较，GC组胃癌组织miR-192表达显著升高（P<0.01），P53 mRNA表达显著降低（P<0.01）。比较mRNA在不同Hp感染者中的表达，结果显示，GC组Hp+者miR-192表达显著升高（P<0.05），P53 mRNA表达显著降低（P<0.05）;对照组Hp+miR-192表达显著升高（P<0.05），P53 mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。结果说明，miR-192和P53 mRNA表达异常与Hp感染和胃癌相关。见图1。

2.3 胃癌组织miR-192表达与临床病理因素的关系

miR-192表达水平与Hp感染、淋巴转移和临床分期显著相关（P<0.05），而与年龄、性别和分化程度无明显相关性（P>0.05）。见表2。117D23AB-06A7-412F-8A2B-D3B8AC70CA84

2.4 转染效果验证

RT-PCR结果显示，对照组与NC组细胞miR-192表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），与对照组比较，Inhibitor组细胞miR-192表达显著降低（P<0.05），Mimics组细胞miR-192表达显著升高（P<0.01），说明转染成功。

2.5 细胞增殖能力比较

MTT结果显示，对照组与NC组细胞增殖活力比较，差异无统计学意义（P>0.05），相较于对照组和NC组，Inhibitor组增殖活力显著降低（P<0.05），Mimics组细胞增殖活力显著升高（P<0.05）。

2.6 miR-192与P53靶向关系验证

荧光素酶报告实验结果显示，在Hp+ MKN-45细胞中，miR-192 mimics抑制P53-WT质粒荧光强度（P<0.05），而对P53-MUT质粒荧光强度无影响（P>0.05）。Western blot结果显示，对照组与NC组比较，P53蛋白相对表达量的差异无统计学意义（P>0.05），与NC组比较，Mimics组P53蛋白表达量显著降低，Inhibitor组P53蛋白表达水平显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。见封三图1。

3 讨论

Hp是胃炎、胃溃疡的主要病因，与胃癌的发生密切相关[7]。Hp从多个方面引发胃癌：①引发胃黏膜致癌物形成：Hp通过粘附作用定植于胃黏膜细胞表面，通过自身分泌的多种酶和细胞毒素诱发癌变，或通过炎症诱发癌变[8]。②促进胃黏膜细胞的增殖和凋亡：Hp感染导致机体释放的炎症因子、活性氧、活性氮可促进细胞增殖。Hp产生的毒力因子对细胞有损伤作用，Hp尿素酶活性与凋亡呈正相关[9-10]。③影响癌基因的表达：ras基因突变后的产物P21蛋白可持续向细胞内传递增殖信号，刺激细胞无限增殖，研究发现胃癌或胃癌前病变组织中ras基因突变者在Hp+组显著高于无感染组，且在Hp+组P21蛋白质表达明显高于无感染组[11]。P53基因监视DNA分子的完整性，当DNA受损不能完成修复时，P53蛋白可诱导细胞凋亡，P53基因突变后则失去该功能。Hp感染时胃内炎症产生的氧自由基、超氧化物等可使P53基因突变或失活[12]。

miRNA是一种单链RNA，以干扰mRNA翻译的方式调控基因表达。miRNA在胃癌发病中起重要作用，且与Hp感染密切相关。Matsushima等[13]发现，Hp感染可导致30个miRNA表达下调，抗Hp治疗后14个下调的miRNA 恢复表达，提示miRNA与Hp感染所致胃炎有关，其机制可能与cagA有关。Hp+胃癌标本较Hp-胃癌标本miR-2l，miR-221及miR-222表达显著增加，miR-218表达下降[14-15]，表明Hp感染可能是通过miRNA异常表达促进胃癌发生。

miR-192能调控细胞的生长、增殖和细胞周期等多种生物学行为，与基因的激活、失活和肿瘤的发生、发展密切相关，是研究癌变机制的热点。miR-192在肝脏和结肠组织中表达丰富，在相应肿瘤组织中表达下调，是一种抑癌miRNA，其在肾脏[16]、大肠腺癌组织[17]均有表达。miR-192可抑制细胞周期，转染miR-192后，大肠癌Hct 116细胞周期停滞在G1和G2-M期[18]。有研究提示，胃癌组织较正常组织miR-192表达上调，miR-192模拟物显著促进胃癌细胞株HFE145生长，其抑制剂抑制胃癌细胞株NCI-N87生长[19]。本研究显示，miR-192在胃癌患者中表达升高，且Hp+胃癌组织中miR-192表达上调，miR-192表达与Hp感染、淋巴转移和临床分期显著相关，提示Hp感染能促进miR-192表达上调，并导致胃癌的发生、发展，与文献研究结果一致。在Hp+MKN-45细胞中抑制miR-192表达，可抑制细胞增殖。在线预测发现P53 3′-UTR区能够与miR-192结合，荧光素酶报告实验证实miR-192与P53的靶向关系。此外，在Hp+胃癌细胞中，miR-192负调控P53在翻译和转录水平上的表达。P53是与人类肿瘤相关的且被广泛研究的基因，正常P53蛋白是一种能通过控制G0～G1期细胞进入S期而抑制细胞增殖的调控因子，发生突变的P53基因会影响蛋白抑制细胞增殖的作用，令肿瘤更易发生侵袭和转移[20]。本研究发现，miR-192可通过直接负调控下游抑癌基因P53的表达，促进Hp+胃癌细胞的增殖过程。

综上所述，miR-192在胃癌患者中表達升高，其变化与Hp感染、淋巴转移和肿瘤分期有关。miR-192是一种促癌miRNA，可能通过靶向抑癌基因P53来促进Hp+胃癌细胞增殖。但关于Hp与miR-192如何相互作用及miR-192是否通过其他机制来调控Hp+胃癌的发生发展仍需进一步深入研究。

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（收稿日期：2021-09-07）117D23AB-06A7-412F-8A2B-D3B8AC70CA84