PRLR基因InDel检测及其与陕北白绒山羊生长性状的关联分析

王聪亮,张政轩，付 琪，魏宇新，白晶晶，宋晓越，李陇平，屈 雷，朱海鲸,2,3*

(1.榆林学院生命科学研究中心，陕西榆林 719000；2.陕西省“四主体一联合”肉羊工程技术校企联合研究中心，陕西神木 719318；3.陕西浩丽绒山羊科技发展有限公司，陕西子洲 718499)

催乳素(Prolactin,PRL)主要是垂体前叶分泌的一种肽类激素，仅包含1个跨膜区域的膜结合蛋白，最早发现于乳腺、卵巢、睾丸等组织，PRL通过与其受体(PRLR)结合作用于靶器官，参与调控乳腺发育、黄体生成、调节渗透压等及繁殖相关激素分泌等多种生理活动。按照PRLR受体胞内域氨基酸数目和胞质区域组成可分为长型PRLR、中型PRLR和短型PRLR，其功能各不相同。据报道，PRL在大鼠、绵羊和牛等多个物种内分布广泛，通过与不同PRLR受体亚型结合介导，作用于相应靶细胞质膜，进而发挥其生物学作用。

基因作为泌乳相关基因，研究人员发现，基因与母猪总产仔数和产活仔数显著相关，可作为猪高产仔数性状的候选基因，国内外研究人员就基因对畜禽泌乳和繁殖性状的影响展开大量研究。如，基因侧翼区一处SNP突变与疆岳驴平均日泌乳量和乳蛋白率显著相关，可作为乳用型疆岳驴选育的有效DNA标记。此外，基因也可作为高产仔数和海门山羊选育的重要候选基因。但基因多态并不是都与动物繁殖相关，如基因多个SNP突变位点与湖羊和济宁青山羊等数个品种的产羔性状无显著关联。陕北白绒山羊作为优秀绒肉兼用品种，目前关于基因与陕北白绒山羊生产相关性状的研究较少。为此，笔者采用PCR扩增和测序技术探究基因InDel多态性及其与不同陕北白绒山羊群体生产性状的相关性，以期为绒山羊的高效选育提供参考。

1 材料与方法

试验羊由陕西应马安绒山羊养殖公司提供，包括618只育成羊(1.0～1.5岁)和558只成年羊(1.5～4.0岁)，均为雌性。剪取试验羊耳尖部约0.4 cm耳组织储存在含有70 %乙醇的1.5 mL Eppedorff管中，同时测量试验羊体重、体高、体长、胸围、髋宽、管围、十字部高、胸深、胸宽、绒细度10个性状数据。同时提取试验羊耳组织DNA，-80 ℃保存备用。

琼脂糖、Marker 1和PCR Master Mix，均购自天根生化科技(北京)有限公司；EB核酸染料，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

参照文献[13]，选取基因第2内含子16 bp InDel突变位点(NC_030827.1.g.61200-61206,61209-61214,61298-61300 del GAGGGC-GGGAGGG-AAG)作为候选变异位点，并利用文献中的引物对候选变异位点进行多态性检测。基因的PCR扩增体系：PCR Master Mix 6.5 μL，上下游引物各0.3 μL，模板DNA 0.7 μL，ddHO补至13 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共38个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃结束反应保存，扩增目的片段长度分别为143 bp和127 bp。PCR扩增产物进行3%琼脂糖凝胶电泳并鉴定分型，引物合成与PCR产物测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

利用Microsoft Excel 2018软件计算基因InDel突变位点的基因型频率和等位基因频率，使用Nei方法计算基因纯合度(Ho)、杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)等群体遗传学参数，使用在线平台SHEsis(https://analysis.bio-x.cn)计算基因多态性是否处于哈代温伯格(HWE)平衡。其生物统计模型为=++，其中为总体平均值，为基因型固定效应，为随机误差。利用SPSS 23.0软件，分别运用独立样本检验和单因素方差方法完成基因陕北白绒山羊育成羊和成年羊群体不同基因型与生长性状的关联分析；再利用Microsoft Excel 2018软件计算不同群体各个性状表型值的平均值，用个体表型值减去平均值得到差值，运用单因素方差方法分析不同基因型与陕北白绒山羊群体生长性状之间的差异显著性，其中育成羊和成年羊为一个整体，结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

扩增产物经3.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1。陕北白绒山羊基因16 bp InDel位点(NC_030827.1.g.61200-61206,61209-61214,61298-61300 del GAGGGC-GGGAGGG-AAG)具有多态性，分别产生了纯合插入型(II，143 bp)、杂合型(ID，143 bp和127 bp)与纯合缺失型(DD，127 bp)3种基因型，产物测序结果见图2，测序结果与PCR扩增结果一致。

注：M.Marker;1,5.ID型;2,3,6.II型;4.DD型Note:M.Marker;1,5.ID type;2,3,6. II type;4.DD type图1 PRLR基因16 bp InDel位点凝胶电泳结果Fig.1 Gel electroresis result of the PRLR gene 16 bp InDel site

图2 PRLR基因16 bp InDel位点(NC_030827.1.g.61200-61206,61209-61214,61298-61300 del GAGGGC-GGGAGGG-AAG)测序结果Fig.2 Sequencing result of the PRLR gene 16 bp InDel site (NC_030827.1.g.61200-61206,61209-61214,61298-61300 del GAGGGC-GGGAGGG-AAG)

基因16 bp InDel突变位点等位基因频率、基因型频率、多态性信息含量(PIC)等群体遗传学参数见表1。结果显示，基因16 bp InDel突变位点在陕北白绒山羊育成羊、成年羊和全部群体中均属于低度多态(PIC<0.25)，I型等位基因频率均高于D型；该突变位点在成年羊群体处于哈代温伯格平衡状态(>0.05)，但在育成羊和全部群体中偏离了哈代温伯格平衡(<0.05)。

表1 陕北白绒山羊群体PRLR基因多态位点遗传参数结果Table 1 Results of genetic parameters of PRLR gene polymorphism locus in Shanbei white cashmere goats

通过SPSS 23.0软件对基因InDel位点多态性与不同陕北白绒山羊群体生长性状进行相关性分析，结果见表2～4。在陕北白绒山羊育成羊群体中(=618)，由于体重和绒细度性状DD基因型只有2个样本，故运用独立样本检验法对其进行相关性分析，结果显示不同基因型与生长性状均无显著关联(表2)；在成年羊群体中(=558)，ID基因型山羊的管围显著高于II基因型(<0.05)(表3)；在育成羊和成年羊全部群体中(=1 176)，ID基因型山羊的管围仍显著高于II基因型(<0.05)，优势基因型与成年羊群体相同，均为ID型(表4)。

表2 陕北白绒山羊育成羊PRLR基因多态位点对生长性状影响的测定结果(n=618)Table 2 Results of determining the effect of PRLR gene polymorphic loci on growth traits in yearling period of Shanbei white cashmere goats (n=618)

表3 陕北白绒山羊成年羊PRLR基因多态位点对生长性状影响的测定结果(n=558)Table 3 Results of determining the effect of PRLR gene polymorphic loci on growth traits in adult period of Shanbei white cashmere goats(n=558)

表4 陕北白绒山羊群体PRLR基因多态位点对生长性状影响的测定结果(n=1 176)Table 4 Results of determining the effect of PRLR gene polymorphic loci on growth traits in all of Shanbei white cashmere goats(n=1 176)

3 讨论

陕北白绒山羊作为国内知名绒肉兼用山羊品种，其中陕北地区是重要养殖区域，产肉性能及遗传稳定性差等是养殖过程中的主要问题。相对传统育种方法而言，分子标记辅助选择技术(MAS)具有选择准确度高、育种周期短等优势，目前已广泛应用于家畜育种，用于改良家畜经济性状，提高生产性能。

多态信息含量等与基因遗传多样性往往具有直接关系。该突变多态信息含量显示，在陕北白绒山羊不同群体中均属于低度多态水平(PIC<0.25)，说明群体遗传变异较小，可适当加强选择强度，但在育成羊和全部群体中偏离了哈代温伯格平衡(<0.05)，说明可能受到遗传漂变及人工选育的影响，而陕北白绒山羊正是人工选育与杂交形成的新品种，等位基因流失可能是其主要影响因素。将基因16 bp InDel突变位点多态性与陕北白绒山羊的生长性状进行相关性分析发现，该突变位点与陕北白绒山羊育成羊生长性状无显著关联，但与成年羊管围性状显著相关；当把育成羊和成年羊作为一个群体分析时，该InDel突变位点仍与管围性状显著相关，优势基因型与成年羊群体相同，均为ID型，具有很好的一致性。在成年羊群体中，该突变位点能显著影响山羊的管围性状，但对育成羊生长性状无显著影响，推测可能存在以下原因：①生长发育阶段不同，育成羊尚未发育完善；②基因表达存在时序性，如基因在牦牛生长发育后期睾丸组织中的表达量极显著高于前期，同时5日龄与8周龄雌性大鼠肝脏组织中基因表达量有较大差异，故基因可能在陕北白绒山羊不同生长发育阶段存在差异表达。同时研究显示，羊体质量与管围性状存在显著关联，表明基因该突变位点可能会间接影响陕北白绒山羊体重性状，其中具体机制仍需要进一步探究。

有报道称，基因分别定位于绵羊、山羊的16、20号染色体，其中在绵羊腹股沟窦、脂肪和山羊肌肉、肝脏及皮下脂肪中存在不同程度的基因表达。目前研究人员普遍认为主要通过JAK2-STAT信号转导途径参与机体调控，通过JAK2酪氨酸激酶的活化对STAT5转录因子进行磷酸化，从而形成同型二聚体，与靶基因启动子上的γ-干扰素激活位点序列特异性结合，激活基因转录，诱导并调控蛋白表达，除此之外，有丝分裂原激活蛋白(MAP)激酶途径也被认为是参与介导PRL调控作用的重要途径。研究显示，催乳素合成分泌与下丘脑多巴胺的调控有直接关系，多巴胺与催乳素细胞表面的多巴胺D2特异性结合，在小鼠中，缺乏多巴胺D2R受体亚型与其体重增加有直接关系，小鼠敲除基因后骨形成速率和骨密度较敲除前有所下降。研究证实，在调控棕色脂肪细胞分化过程中发挥重要作用，在刺激NIH3T3细胞快速增殖的同时还能有效促进细胞分裂蛋白激酶的激活。同时研究人员发现，在牦牛等动物肝脏、骨骼肌和肾脏均有较高表达水平，并且基因p.H406R和p.M480T 2个错义突变位点多态与大白猪背部脂肪有显著影响，说明基因可能参与早期动物胚胎及机体的生长发育。

综上所述，基因16 bp InDel突变对陕北白绒山羊管围性状有显著影响，可作为陕北白绒山羊优良生长性状选育的重要候选基因。

4 结论

该研究验证了基因在陕北白绒山羊群体中存在1个16 bp的插入缺失，并发现该突变位点对陕北白绒山羊群体部分生长性状存在显著关联，提示该位点可作为陕北白绒山羊分子标记辅助育种的有效DNA标记。