大豆GmCBL7-2生物信息学及非生物胁迫表达分析

陈炯辛，张军，马婷婷，李铭杨，于海伟，李珊珊，兰红宇，翟莹

大豆生物信息学及非生物胁迫表达分析

陈炯辛1，张军2，马婷婷1，李铭杨1，于海伟1，李珊珊1，兰红宇3，翟莹1

（1.齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省农业科学院 畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161005；3.黑龙江省农业科学院 齐齐哈尔分院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

钙调磷酸酶B类似蛋白（CBL）作为植物钙离子信号感受器，在植物非生物胁迫和信号转导中发挥重要作用。对大豆基因进行生物信息学分析及非生物胁迫下表达量的检测。基因开放阅读框全长639 bp，编码一个含212个氨基酸的蛋白质，相对分子量24.4 kD，等电点4.56，属于亲水性蛋白。预测结果显示，GmCBL7-2蛋白主要定位于细胞质中，含有13个磷酸化位点。GmCBL7-2蛋白质3D结构模型中存在两个Ca2+结合位点。GmCBL7-2蛋白与拟南芥AtCBL7蛋白亲缘关系最近。表达量检测结果显示，在大豆幼苗中可以响应干旱、高盐及低温胁迫，且对干旱胁迫的响应更加显著。

大豆；钙调磷酸酶B类似蛋白；生物信息学；非生物胁迫

环境中的非生物胁迫（干旱、低温和盐碱等）会严重影响植物的生长发育。植物中的钙信号通路广泛参与植物非生物胁迫耐受机制。在非生物胁迫下，植物细胞内Ca2+浓度迅速增加，通过Ca2+感受器与Ca2+的结合调控下游靶蛋白，诱导细胞产生相应的应激反应，促进植物对各种非生物胁迫的耐受性[1-2]。

钙依赖磷酸酶B类似蛋白（Calcineurin B-like protein, CBL）是植物中Ca2+信号感受器的一种，它能够与蛋白激酶（CBL-interacting protein kinases, CIPK）互作形成CBL-CIPK复合体，在植物响应非生物胁迫过程中发挥重要作用[3]。CBL蛋白家族成员一般具有不同数量的EF手型结构域，负责与Ca2+结合[4]。拟南芥基因组中报道了10个CBL基因[5]。其中，被干旱和低温胁迫诱导表达[6]；能够提高转基因拟南芥渗透和干旱胁迫抗性[7]；AtCBL10与AtCIPK24形成蛋白复合体参与拟南芥的耐盐性[8]。水稻中的10个CBL基因也能响应非生物性胁迫，且转基因水稻表现出更强的耐盐性[9]。紫花苜蓿通过调控根中钙的积累增强转基因烟草的耐盐碱胁迫能力[10]。

大豆富含优质蛋白质，也是良好的食用油原料。在我国，大豆依赖进口的情况较为严重。非生物胁迫是影响大豆产量的重要因素之一，提高国内大豆品种抵抗非生物胁迫的能力可以有效缓解大豆依赖进口的情况。

研究发现，大豆和均受到多种非生物胁迫的诱导表达，过表达或能够提高转基因植株的抗盐及抗旱性[11-12]。本研究从在线数据库中获得一个大豆CBL基因，对该基因进行生物信息学分析及非生物胁迫下基因表达量的检测，为大豆非生物胁迫抗性基因的筛选提供理论参考。

1 实验部分

1.1 实验材料

所使用的大豆种子（北豆9号）是由齐齐哈尔大学植物分子育种研究室提供的。

1.2 生物信息学分析

从NCBI数据库中下载基因及蛋白氨基酸序列。在线网站NCBI ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）预测基因开放阅读框。利用在线网站ExPASy（https://web.expasy.org）分析GmCBL7-2蛋白的分子量、等电点和亲/疏水性。利用在线软件PSORT（https://www.genscript.com/tools/psort）预测GmCBL7-2蛋白的亚细胞定位。在线网站NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测GmCBL7-2蛋白的磷酸化位点。利用在线网站SWISS-MODEL（http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html）构建GmCBL7-2蛋白3D模型，进行3D结构预测。使用MEGA5软件构建CBL蛋白系统进化树。

1.3 非生物胁迫处理

挑选饱满的大豆种子，均匀播撒在细沙和草炭土中（1∶1混合）。7d后将生根的大豆幼苗移入Hoagland营养液中进行水培，水培过程中每2～3d更换一次营养液。待幼苗第一片三出复叶展开后进行以下处理：分别将幼苗根部完全浸没在含有20% PEG8000和200 mmol/L NaCl的Hoagland营养液中进行干旱和高盐胁迫处理；4℃培养箱中进行幼苗的低温胁迫处理。在处理前（0h）及处理后1, 2, 5, 10, 24h分别剪取0.1g大豆幼苗第一片三出复叶，取样后于液氮中速冻并尽快转移至-80℃超低温冰箱中保存。

1.4 总RNA提取及反转录cDNA

使用Takara公司的RNAiso Plus试剂进行大豆叶片总RNA的提取，具体实验操作参考产品说明书。提取的总RNA经Novoprotein公司的反转录试剂盒反转录成cDNA后于-20℃保存。

1.5 实时荧光定量PCR

利用Primer 5软件设计实时荧光定量PCR的引物。上游引物5′-TCTAGCATCAGAGACAGCCTTCAG-3′，下游引物5′-TCCATCATCAACGACGGACCTAC-3′。使用Novoprotein公司SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒进行实时荧光定量PCR，内参基因、参数设置和体系均参照QIU等[13]。

1.6 数据处理

实时荧光定量PCR数据差异显著性分析采用Student's检验。

2 结果与讨论

2.1 GmCBL7-2基因及蛋白序列分析

基因（GenBank登录号：XM003538711）及蛋白氨基酸序列如图1所示。

图1 GmCBL7-2基因及蛋白氨基酸序列

基因开放阅读框全长639bp，编码的蛋白质含212个氨基酸，预测该蛋白相对分子量为24.4kD，预测等电点为4.56，化学式为C1108H1708N270O333S8，原子总数为3427个。GmCBL7-2蛋白平均亲水系数为-0.106，表明该蛋白属于亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果显示，GmCBL7-2蛋白无信号肽和核定位信号，属于非分泌性蛋白，定位于细胞质中（可信度94.1%）。蛋白在细胞内的定位与细胞内信号响应过程相关。研究表明不同CBL蛋白在细胞内的定位情况存在很大差异，例如拟南AtCBL1定位在细胞膜上，AtCBL2定位在液泡膜上，AtCBL3在细胞膜和液泡膜上均存在，而AtCBL4和AtCBL5在细胞膜、细胞质和细胞核中均存在[14]。磷酸化位点预测结果如图2所示，GmCBL7-2蛋白含有丝氨酸磷酸化位点9个，苏氨酸磷酸化位点3个及酪氨酸磷酸化位点1个，推测这些磷酸化位点的存在可能与蛋白的空间结构、活性及信号转导等相关[15]。蛋白质3D结构预测模型如图3所示，GmCBL7-2蛋白存在两个Ca2+结合位点。

图2 GmCBL7-2蛋白磷酸化位点预测

图3 GmCBL7-2蛋白3D结构预测（方框代表Ca2+结合位点）

2.2 植物CBL蛋白系统进化分析

将GmCBL7-2与已鉴定功能的GmCBL1，GmCBL7及拟南芥CBL蛋白构建系统进化树。结果显示（图4），GmCBL7-2蛋白与AtCBL7蛋白的亲缘关系最近，它们可能具有类似的功能。报道显示，AtCBL7蛋白与GmCBL7-2蛋白类似，也主要定位于细胞质中，它可以调控拟南芥对硝酸盐缺乏的响应[16]。鉴于大豆中已鉴定了一个基因[12]，所以本研究中的基因命名为。

图4 植物CBL蛋白系统进化树

2.3 GmCBL7-2非生物胁迫下表达分析

以未处理（0 h）大豆幼苗作为对照，利用实时荧光定量PCR对在干旱、高盐和低温胁迫下的表达量进行检测。如5所示，干旱处理后的表达量显著升高，在处理1 h时表达量达到峰值，为对照组的49倍，处理24 h时表达量下降至对照组的1.4倍。高盐处理后，表达量峰值出现在处理后2h，仅为对照组的2倍，在处理10～24h，表达量已经低于对照组。低温处理后，表达量在处理2h时达到峰值，为对照组的5倍，后下降，在处理5～10h表达量低于对照组，直到处理24h时表达量再次升高。基因表达量检测结果表明，在大豆幼苗中可以响应干旱、高盐及低温胁迫，且对干旱胁迫的响应更加显著。

图5 GmCBL7-2在非生物胁迫下的表达

a：在干旱胁迫下的表达；b：在高盐胁迫下的表达，c：在低温胁迫下的表达；*和**分别代表差异达到显著（P<0.05）和极显著（P<0.01）

3 结论

大豆基因开放阅读框全长639bp，编码一个含212个氨基酸的蛋白质，相对分子量24.4 kD，等电点4.56，属于亲水性蛋白。GmCBL7-2蛋白主要定位于细胞质中，含有13个磷酸化位点。GmCBL7-2蛋白质3D结构模型中存在两个Ca2+结合位点，与拟南芥AtCBL7蛋白亲缘关系最近。在大豆幼苗中可以响应干旱、高盐及低温胁迫，且对干旱胁迫的响应更加显著。

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Bioinformatics and abiotic stress expression analysis ofin soybean

CHEN Jiong-xin1，ZHANG Jun2，MA Ting-ting1，LI Ming-yang1，YU Hai-wei1，LI Shan-shan1，LAN Hong-yu3，ZHAI Ying1

(1.College of Life Science and Agroforestry, Qiqihar University, Heilongjiang Qiqihar 161006, China; 2.Branch of Animal Husbandry and Veterinary of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Heilongjiang Qiqihar 161005, China; 3.Qiqihar Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Heilongjiang Qiqihar 161006, China）

Calcineurin B-like protein (CBL) act as calcium ion signaling receptor, which play an important role in plant abiotic stress and signal transduction.In this study, thegene from soybean was analyzed by bioinformatics and its expression level was detected under abiotic stress.The open reading frame ofwas 639 bp, encoding a protein containing 212 amino acids with relative molecular weight of 24.4 kD and isoelectric point of 4.56. GmCBL7-2 protein was a hydrophilic protein.The predicted results showed that GmCBL7-2 protein was mainly located in the cytoplasm and contained 13 phosphorylation sites.There were two Ca2+binding sites in 3D structural model of GmCBL7-2 protein.GmCBL7-2 protein is most closely related toAtCBL7 protein.The expression level ofin soybean seedlings showed thatcould respond to drought, salt and cold stresses, and the response to drought stress was more significant.

soybean；calcineurin b-like protein；bioinformatics；abiotic stress

2021-12-31

黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划（UNPYSCT-2017153）；齐齐哈尔大学研究生创新科研项目（YJSCX2020041）

陈炯辛（1998-），男，陕西汉中人，学士，主要从事植物分子遗传育种研究，c940149536@iCloud.com。

翟莹（1982-），女，吉林吉林人，教授，博士，主要从事植物分子遗传育种研究，fairy39809079@126.com。

S565.1

A

1007-984X(2022)05-0074-05