10种植物醇提物对木腐菌的抑菌活性筛选*

罗忠友 韦小丽 余丽萍 李利芬 吴志刚 吴 蝶

（贵州大学林学院，贵州 贵阳 550025）

木材作为一种可再生的生物质材料，因具有色彩明亮、触感温润、纹理美观、环保可降解等优点广受人们喜爱，被广泛应用于建筑、家具、造船、造纸等领域[1]。截至2020年，我国是世界第一大木材消费国和进口国，木材需求量达到7.6亿 m3，人工林面积世界第一，但人均森林面积不足世界平均水平的1/4，对外依存度高达24%[2]。随着天然林保护工程和生态文明建设深入推进，人民生活水平不断提高使得木材的需求量激增，导致我国木材紧缺现象日益突出。因人工林材质疏松、密度较小极易引起木材腐朽、霉变等使木材使用寿命缩短，每年给我国带来高达数百亿元的经济损失。因此，对其进行防腐处理是缓解国内木材供需矛盾、延长木材使用寿命、节约木材的重要手段。一些传统木材防腐剂如林丹、五氯酚钠、铜铬砷（CCA）等被限制使用。市场上常用的木材防腐剂为ACQ，但其含有的金属铜离子易流失，可能对环境和人体健康造成危害。因此，现阶段寻找开发新型环保高效的防腐剂成为木材保护研究领域的热点[3-4]。目前，国内外新型防腐剂的主要研究方向为无机硼盐[5]、有机杀菌剂[6-7]和植物源木材防腐剂[8-10]。其中，植物源木材防腐剂主要来源于植物细胞，容易均匀分散在木材内部且不易流失，其低毒、高效、可再生、可降解、靶标性强等特点是其他天然防腐剂无可比拟的，近年来受到广大研究者的关注[11-13]。由于全球植物近50万种，种类繁多，次生代谢产物超40万种[14]，一直以来，筛选广谱杀菌性的植物来源和活性化合物是开发植物源木材防腐剂的难点和基础。本研究在前人研究的基础上，选用已知具有抑菌活性的10个木本植物干叶，通过比较其乙醇提取物对4种常见木腐菌的抑制作用，优选高效广谱的抑菌植物来源，以便为后续开发木材防腐剂提供基础数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物：均来自贵州省花溪区和台江县，共5科9属10种（详见表1），供试部位均为叶片，经40 ℃干燥箱烘干至恒重，粉碎过40目筛后密封保存备用。

表1 供试植物基本信息Tab.1 List of tested plants

试剂：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），杭州百思生物技术有限公司；无水乙醇，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；蒸馏水，自制。

菌种：白腐菌，黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）和采绒革盖菌(Coriolus versieoly)；褐腐菌，密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）和绵腐卧孔菌（Poria vaporaria）；均由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供。

1.2 仪器与设备

CJ-20型净化工作台，WGL-230B型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；400Y型多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；YP502A型电子天平，上海浦春计量仪器有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅，常州朗越仪器制造有限公司；JJ-1B型恒温水浴电动搅拌器，金坛区西城新瑞仪器厂；TD5A型台式低速离心机，盐城市凯特实验仪器有限公司；冰禹BYA-258布氏漏斗，冰禹（ICEY）实验室用品；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，RE-6000A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；GI80TW型立式自动压力蒸气灭菌器，致微（厦门）仪器有限公司；无菌操作台BSC-400型恒温恒湿箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂等。

1.3 试验方法

1.3.1 植物乙醇提取物制备

准确称取20 g植物样品，以50%乙醇溶液为溶剂按1∶16比例混合倒入500 mL锥形瓶中，50 ℃恒温水浴搅拌提取60 min后，离心10 min转速为4 000 r/min，真空泵结合布氏漏斗减压过滤收集滤液。将滤液倒入旋蒸瓶使用旋转蒸发仪蒸干得到膏状物，置于60 ℃鼓风干燥箱中烘至恒重，称量并计算提取率。最后用无菌水将提取物溶解配制成浓度为200 mg/mL的母液，置于4 ℃下冰箱中密封保存备用。

1.3.2 抑菌活性筛选试验

采用菌丝生长速率之含毒介质法对10种醇提物的抑菌活性进行筛选，以无菌水为空白对照，设3组重复。先将供试真菌用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）在平板活化7～10 d，把配制好的PDA培养基置于蒸气灭菌器中121 ℃灭菌30 min后，转移至无菌操作台冷却至50 ℃左右，使用移液枪吸取醇提物母液按1∶9比例与培养基混合配制成质量浓度为20 mg/mL的含药培养基，摇晃均匀倒入内径为85 mm的培养皿中，每皿约10 mL，待自然冷却凝固后制成带药平板。将活化后的菌种沿菌落边缘用直径0.7 cm打孔器制备菌饼，用接种环将菌饼放入带药平板中央，菌丝面朝下，移入相对温度28 ℃和相对湿度80%的恒温恒湿培养箱中进行黑暗培养。通过十字交叉法采用游标卡尺定期测量不同时间（3、5 d和7 d）的菌落直径，计算其平均值和抑菌率。

1.3.3 数据分析

试验结果采用Excel软件计算菌落平均直径和抑菌率，并用SPSS 22.0进行方差分析（p＜0.05）和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 供试植物基本信息

供试植物及其乙醇提取物基本信息详见表1，10种植物的提取率均高于10%。

2.2 对白腐菌的抑菌活性分析

10种植物乙醇提取物在不同时间对2种白腐菌的抑菌效果见表2和表3。当菌落培养3 d时，黄孢原毛平革菌的空白对照组已长满培养皿，10种植物对黄孢原毛平革菌的生长抑制效果显著，且抑菌率均高于50%，其中飞龙掌血和香樟高达100%。随着时间延长，部分植物乙醇提取物的抑菌效果有明显下降，其中8种对黄孢原毛平革菌的抑菌率完全无抑制，说明其提取物活化物的长效性较差。到第7 d时，对黄孢原毛平革菌的抑制效果达到50%以上的植物仅为香樟（100%）和飞龙掌血（81.80%），而闽楠的抑菌效果较差。除闽楠外，其余9种植物提取物均对采绒革盖菌具有抑制作用，其中飞龙掌血抑制效果高于50%。随着时间延长，部分植物乙醇提取物的抑菌效果明显下降，而飞龙掌血对采绒革盖菌的抑菌率由93.39%下降至71.59%。7 d时仅飞龙掌血和香樟对2种白腐菌均有抑菌作用，且抑制效果较好，而柏木、榉树、花椒、银杏和榉树5种植物对2种白腐菌完全无抑制作用。

表2 10种植物醇提物不同时间对黄孢原毛平革菌的抑菌分析Tab.2 Bacteriostatic analysis of ethanol extracts from 10 plants against P. chrysosporium

表3 10种植物醇提物不同时间对采绒革盖菌的抑菌分析Tab.3 Bacteriostatic analysis of ethanol extracts from 10 plants against C. versieoly

（续表3）

2.3 对褐腐菌的抑菌活性分析

由表4和表5可知，浓度为20 mg/mL的10种植物醇提物在测试的不同时间段对2种褐腐菌均有显著抑制作用。当测试3 d时，有4种植物对密粘褶菌和10种植物对绵腐卧孔菌的抑制率达到50%以上，其中飞龙掌血、猴樟、香樟、圆柏对2种菌均有效。到7 d时，部分醇提物对褐腐菌的抑制作用有所下降，其中3种植物对密粘褶菌有效抑制达到50%，有4种植物对绵腐卧孔菌抑制效果高达75%，其中飞龙掌血抑菌率为100%。对2种褐腐菌抑制效果均在50%以上的植物为飞龙掌血、猴樟和香樟，其中飞龙掌血效果最佳，香樟次之。

表4 10种植物醇提物不同时间对密粘褶菌的抑菌分析Tab.4 Bacteriostatic analysis of ethanol extracts from 10 plants on G. trabeum

表5 10种植物醇提物不同时间对绵腐卧孔菌的抑菌分析Tab.5 Bacteriostatic analysis of ethanol extracts from 10 plants on P. vaporaria

2.4 聚类分析

以植物乙醇提取物7 d时的抑菌率为变量，利用SPSS软件系统聚类分析得到树状图，如图1所示。由图可知，飞龙掌血（1）和香樟（10）的抑菌效力表现最好，榉树（3）、猴樟（4）和圆柏（9）表现为中等，其余5种植物的抑菌效果较差。飞龙掌血和香樟乙醇提取物7 d时对4种木材腐朽菌的抑菌效果见图2。与对照组相比，香樟和飞龙掌血对4种菌均有抑制作用，香樟对黄孢原毛平革菌的菌丝生长起到完全抑制作用，飞龙掌血有少量菌丝生长，效果比香樟差；而飞龙掌血对其他3种菌的抑菌作用均比香樟强。此外，飞龙掌血中含有大量香豆素类、生物碱类、三萜类、黄酮类等生物活性物质，具有抑菌、抗氧化、杀虫等功能[15,16]。飞龙掌血石油醚和乙酸乙酯提取物对2种金黄色葡萄球菌存在抑制作用，其活性化合物为白屈菜红碱[17]。飞龙掌血乙醇提取物对枯草杆菌、痢疾杆菌、啤酒酵母菌有较强抑制作用[18]，也能抑制白色念珠菌的菌丝形成破坏其细胞壁，其最小抑菌浓度为7.5 g/mL[19]。李在留等[20]通过筛选17种植物醇提物对蓝变菌可可球二孢的抑菌活性，发现飞龙掌血抑菌效果最佳。这些研究说明飞龙掌血提取物对多种细菌、木霉菌和木腐菌均有较好的抑菌效果。香樟作为我国传统抑菌植物，诸多学者通过研究香樟提取物对木竹材的防腐防霉机理、增效、应用等方面证实了香樟具备开发新型木材防腐剂的潜力[21-27]。

图1 植物乙醇提取物7 d时抑菌率聚类分析树状图Fig. 1 Cluster analysis tree of inhibition rate of plant ethanol extract for 7 days

图2 飞龙掌血和香樟乙醇提取物7 d时对4种菌的抑制效果Fig. 2 Inhibitory eあects of T. asiatica and C. camphora ethanol extract on 4 kinds of bacteria after 7 days

3 结论

不同植物对不同菌种（或同一菌种）的抑菌作用不同，同一植物因含有的化合物不同对不同菌种的差异性也比较大。本文筛选了10种植物干叶的乙醇提取物对2种白腐菌和2种褐腐菌的抑菌活性。结果表明：在供试浓度为20 mg/mL的条件下，10种植物乙醇提取物在不同时间对木腐菌均有一定的抑制效果，但对褐腐菌的总体抑菌效果较白腐菌强；当菌落生长至7 d时，有6种植物对白腐菌和褐腐菌均有抑制作用，其中飞龙掌血和香樟对4种腐朽菌均有抑制效果；飞龙掌血对4种木腐菌的总体抑菌效果较香樟强，且抑菌率均高于70%；而香樟对采绒革盖菌的抑制效果较差，仅对其他3种菌的抑制效果达到70%以上。聚类分析结果显示，飞龙掌血和香樟对4种木材腐朽菌的总体抑菌效力表现最好，结合前人的研究结果证实了这2种植物均具有开发植物源木材防腐剂的潜力。在未来，植物源木材防腐剂是开发应用环保型木材防腐剂的主流趋势，其可从生产废料（如废弃农作物、工业废料等）中获取原料，并能有效替代有毒化学防腐剂，通过对木材的保护、提高木材利用率、保护森林资源以及促进多领域协同可持续发展达到多层生态效应的作用。