HO-1基因修饰的内皮祖细胞对压力负荷型高血压大鼠心肌肥厚的治疗作用

刘 慧，刘 聪，刘 静，党晶艺，任 何，刘 军

(1 中国人民解放军空军军医大学第二附属医院心血管内科，西安 710032；2 中国人民解放军空军军医大学第二附属医院老年病科；*通讯作者,E-mail:24226008@qq.com)

高血压是世界上最普遍的疾病之一，可导致心肾脑等靶器官损伤，心肌肥厚是高血压导致心脏损害的重要病理改变[1]。医学文献中出现了多种假说来解释高血压和相关靶器官损伤的发病机制。其中，血管内皮细胞的功能和结构改变在高血压相关靶器官损伤和不良心血管结局的发展中起着不可或缺的作用[2]。如何改善内皮功能已成为心血管疾病治疗的新思路。1997年Asahara等[3]首次揭示的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)最初被认为是一组来自骨髓的细胞，参与血管内皮的生成和修复。此后，EPC生物学异常与心血管不良事件风险升高之间的相关性被证实[4]，提示EPC受损可能是高血压相关靶器官损伤的一种原因。高血压后来被证实是冠状动脉疾病患者EPC功能下降最重要的独立预测因子[5]。EPC可转化为血管内皮细胞，外周血源性EPC可改善心肌缺血再灌注大鼠模型的内皮功能，降低心肌梗死面积，促进心肌细胞存活[6]。但移植EPC是否可改善高血压心肌肥厚目前尚不清楚。

高血压引起的EPC黏附、迁移等能力下降是EPC移植中的重要瓶颈[7]，因此有必要通过分子生物学手段对移植前的EPC进行预处理，从而提高EPC移植的效果。血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是机体内重要的抗氧化酶，具有影响细胞增殖、抗凋亡、抗炎、调节血管生成等多项生理功能[8]。另外，HO-1具有分子量较小、底物在血液中分布广泛、代谢产物CO易弥散等优点。基于上述背景，本研究推测在治疗心血管疾病时，通过对EPC进行HO-1基因修饰可能有助于提高疗效。已有文献报道[9]，HO-1基因修饰的EPC促进后肢缺血大鼠模型缺血肢体的血管生成，HO-1基因修饰的EPC可能为下肢缺血性疾病提供一种新的有效治疗策略[9]。因此，本研究观察HO-1基因修饰的EPC对压力负荷型高血压大鼠心肌肥厚的治疗作用，并初步揭示其分子机制，旨在探讨高血压心肌肥厚防治的新策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 淋巴细胞分离缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；EGM-2MV培养基(美国Lonza公司)；Lipofectamine 3000(美国Thermo Fisher Scientific)；苏木精-伊红(HE)染色和Masson三色染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；心钠素(ANP)ELISA试剂盒(博辉生物科技(广州)有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；白介素-17(IL-17)和转化生长因子-β(TGF-β)ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)；TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)；PrimeScript RT试剂盒和SYBR Prime Script RT-PCR试剂盒(日本Takara公司)；NP-40裂解液(碧云天生物技术研究所)；BCA检测试剂盒和ECL-Plus化学发光试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；SDS-PAGE(北京康为世纪生物科技有限公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；一抗和二抗(美国Abcam公司)。

1.1.2 实验动物 60只雄性无特定病原体(SPF)级SD大鼠(6～7周龄，体质量200～250 g)和5只雄性SPF级SD大鼠(3～4周龄，体质量60～80 g)由空军军医大学唐都医院功能性脑疾病研究所提供。所有大鼠在SPF级环境中于12 h/12 h光暗循环下饲养，不限制饮食。实验前对大鼠进行1周的预适应饲养。

1.2 方法

1.2.1 大鼠EPC的分离、培养及鉴定 5只3～4周龄SD大鼠用3%戊巴比妥钠以40 mg/kg的剂量麻醉，颈椎脱臼处死。分离大鼠四肢骨(尺骨、桡骨、股骨、肱骨、胫骨)。然后使用10 ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)反复吸取和冲洗骨髓腔。通过密度梯度离心法提取骨髓单个核细胞，骨髓悬液与大鼠淋巴细胞分离缓冲液混合并离心(1 900g，20 min)，收集单个核细胞并在含有10% FBS的EGM-2MV培养基中培养，培养环境设置为37 ℃、5% CO2。培养72 h后，贴壁细胞为EPC，于上述相同条件下在新鲜内皮生长培养基-2 MV(endothelial growth medium-2 MV，EGM-2MV)培养基中进一步培养，每2 d更换一次培养基。初代EPC达到80%汇合后传代，收集第二代和第三代EPC进行鉴定和后续实验。

通过流式细胞仪鉴定EPC。收集EPC并与FITC标记的内皮祖细胞的标志物(CD34、CD133和KDR)抗体孵育，稀释度均为1 ∶500。然后在BD FACSCalibur流式细胞仪上分析EPC。

1.2.2 细胞分组及转染 将EPCs分为对照组(未转染)、pcDNA3.1-HO-1组(转染含有HO-1过表达序列的pcDNA3.1质粒)和pcDNA3.1-NC组(转染阴性对照pcDNA3.1质粒)，质粒由上海吉玛制药技术有限公司合成。转染前，EPC悬浮在含有10% FBS的EGM-2MV培养基中，并在6孔板中培养(每孔含有1.0×106个EPC和2 ml培养基)。达到约80%汇合后，使用Lipofectamine 3000将pcDNA3.1-HO-1或pcDNA3.1-NC质粒转染到EPC中，转染48 h。然后通过RT-PCR和Western blotting检测HO-1的mRNA和蛋白水平，并通过伤口愈合实验评价EPC的迁移能力。

1.2.3 伤口愈合实验 将1.2.2中提到的各组EPC(5×105个细胞)接种于24孔板中，达到100%汇合后，用200 μl无菌移液管尖端在24孔板中划一条划痕。PBS清洗去除游离EPC后，用无血清EGM-2MV培养液孵育24 h，用奥林巴斯倒置显微镜在100倍放大倍数下分别于0 h和24 h拍摄照片，并计算伤口愈合率。

1.2.4 压力负荷型高血压(POH)动物模型的制备 48只6～7周龄SD大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，仰卧固定，腹部碘伏消毒。然后腹中线左侧0.5 cm处切开皮肤，露出左肾动脉上方的腹主动脉。将7号针与腹主动脉平行放置，用6-0号缝合线结扎腹主动脉，然后轻轻取下针头并逐层缝合皮肤。12只假手术大鼠在不结扎腹主动脉的情况下进行相同的手术步骤。术后所有大鼠每天分别给予20万单位青霉素，连续3 d。

1.2.5 动物分组及治疗 建模后，将模型大鼠随机分为假手术组、POH组、EPC组、pcDNA3.1-NC-EPC组和pcDNA3.1-HO-1-EPC组，每组12只大鼠。假手术组和POH组大鼠颈静脉注射0.5 ml PBS，EPC组大鼠注射0.5 ml PBS重悬的EPC(2.0×103/ml)，pcDNA3.1-NC-EPC组大鼠注射0.5 ml PBS重悬的pcDNA3.1-NC-EPC(2.0×103/ml)，pcDNA3.1-HO-1-EPC组大鼠注射0.5 ml PBS重悬的pcDNA3.1-HO-1-EPC(2.0×103/ml)，各组大鼠每周均注射1次，连续4周。治疗4周后，分别检测各组大鼠的血压和血流动力学参数，通过HE染色和Masson三色染色分别测量心肌细胞直径和纤维化程度，采用ELISA法检测血浆ANP、血清SOD、CAT、MDA、IL-17和TGF-β水平，采用比色法测定血清乳酸脱氢酶(LDH)水平，通过RT-PCR检测心肌组织HO-1基因相对水平通过Western blotting检测心肌组织HO-1蛋白表达量。

1.2.6 血压和血流动力学参数测量 治疗结束时，所有大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉。收缩压(SBP)通过美国BIOPAC MP160多导生理记录仪测量。采用Visual Sonics Vevo 2100超高分辨率小动物超声成像系统进行超声心动图检查，测量各组大鼠的左室射血分数(EF)、左室缩短分数(FS)。

1.2.7 组织病理学检查 处死大鼠并分离心脏，用预冷的PBS冲洗。4%多聚甲醛固定左心室，石蜡包埋，制备4 μm厚的组织切片，通过HE染色和Masson三色染色分别测量心肌细胞直径和纤维化程度。用Leica光学显微镜分析每个切片50个心肌细胞。所选心肌细胞呈圆形，位于心室壁心内膜下层。使用Image Pro Plus 6.0软件测量平均心肌细胞直径，并作为心肌细胞肥大的指标。使用Image Pro Plus 6.0软件计算每个切片的胶原面积百分比，表示为纤维化面积百分比。

1.2.8 血液生化指标的检测 大鼠眼眶后静脉丛采血，离心分离血浆和血清。采用ELISA法检测血浆ANP、血清SOD、CAT、MDA、IL-17和TGF-β水平，采用比色法测定血清乳酸脱氢酶(LDH)水平。

1.2.9 RT-PCR检测HO-1基因相对水平 根据说明使用TRIzol试剂分离EPC和心肌组织总RNA，PrimeScript RT试剂盒用于逆转录合成cDNA。使用SYBR Prime Script RT-PCR试剂盒在ABI 7500型实时荧光定量PCR系统上进行qRT-PCR。通过2-ΔΔCt方法确定mRNA相对表达量。引物序列如下：HO-1正向：5′-ACAGAAGAGGCTAAGACCG-3′，反向：5′-CAGCCCTACTTGGTTAGAAT-3′；β-actin正向：5′-CCTTCCTGGGTATGGAATCCT-3′，反向：5′-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3′。β-actin作为内参基因。

1.2.10 Western blotting检测HO-1蛋白表达量 使用NP-40裂解液提取EPC和心肌组织总蛋白。用BCA检测试剂盒测定蛋白质浓度。将20 μl总蛋白与5 μl 5×蛋白上样缓冲液混合，100 ℃下变性5 min。冰上放置10 min后，将25 μl蛋白溶液加入10% SDS-PAGE凝胶的泳道中，在100 V、4 ℃下电泳1.5 h，随后转移到PVDF膜。与5%的牛血清白蛋白孵育1 h后，将膜与以下一抗在4 ℃下孵育过夜：抗HO-1(1 ∶1 000)和抗β-actin(1 ∶5 000)。第2天，将膜与HRP标记的山羊抗兔IgG H&L(1 ∶1 000)室温孵育2 h。然后使用ECL-Plus化学发光试剂盒进行显影。使用Image J软件进行光密度分析。β-actin作为内参蛋白。

1.3 统计分析

采用SPSS21.0统计软件对结果进行统计分析。细胞实验中每组6个重复，动物实验中每组12个重复。所有数据均以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析及LSD事后检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EPC的鉴定结果及转染效率

流式细胞仪检测结果显示，内皮祖细胞的标志物(CD34、CD133和KDR)在分离的EPC中呈阳性表达。转染后，各组EPC中HO-1的mRNA和蛋白表达水平差异有统计学意义(mRNA：F=942.796，P<0.001；蛋白：F=4 472.320；P<0.001)。与对照组相比，pcDNA3.1-HO-1组HO-1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05，见图1)。

与对照组比较，* P <0.05图1 EPC的鉴定及各组EPC中HO-1的表达Figure 1 Identification of EPCs and expression of HO-1 in EPC in each group

2.2 上调HO-1的表达对EPC迁移能力的影响

伤口愈合实验结果显示，各组EPC的迁移能力差异有统计学意义(F=25.909，P<0.001)；与对照组相比，pcDNA3.1-HO-1组的伤口愈合率显著升高(P<0.05，见图2)。

2.3 HO-1基因修饰的EPC对POH大鼠血压和血流动力学参数的影响

与假手术组相比，POH组大鼠的SBP水平升高，而EF和FS水平降低(均P<0.05)。与POH组相比，EPC组、pcDNA3.1-NC-EPC组和pcDNA3.1-HO-1-EPC组大鼠的SBP水平均降低，而EF和FS水平均升高(P<0.05)。与EPC组相比，pcDNA3.1-HO-1-EPC组大鼠的SBP水平降低，而EF和FS水平升高(P<0.05，见表1)。

表1 各组大鼠的SBP、EF和FS水平Table 1 SBP, EF and FS levels of rats in each group

2.4 HO-1基因修饰的EPC对POH大鼠心肌细胞直径和心肌纤维化的影响

HE染色结果显示，与假手术组相比，POH组大鼠的心肌细胞直径升高(P<0.05)；与POH组相比，EPC组、pcDNA3.1-NC-EPC组和pcDNA3.1-HO-1-EPC组大鼠的心肌细胞直径均降低(P<0.05)；与EPC组相比，pcDNA3.1-HO-1-EPC组大鼠的心肌细胞直径降低(P<0.05，见图3)。

图3 各组大鼠心肌组织的HE染色 (×200)Figure 3 HE staining of myocardial tissues in rats in each group (×200)

Masson三色染色结果显示，与假手术组相比，POH组大鼠的心肌纤维化面积升高(P<0.05)；与POH组相比，EPC组、pcDNA3.1-NC-EPC组和pcDNA3.1-HO-1-EPC组大鼠的心肌纤维化面积降低(P<0.05)；与EPC组相比，pcDNA3.1-HO-1-EPC组的心肌纤维化面积降低(P<0.05，见图4)。

图4 各组大鼠心肌组织的Masson三色染色 (×200)Figure 4 Masson trichrome staining of myocardial tissue in rats in each group (×200)

2.5 HO-1基因修饰的EPC对POH大鼠血液生化指标的影响

各组大鼠血浆ANP及血清LDH、SOD、CAT、MDA、IL-17和TGF-β水平差异有统计学意义(P<0.001，见表2)。与假手术组相比，POH组大鼠的血浆ANP、血清LDH、MDA、IL-17和TGF-β水平升高，SOD和CAT水平降低(P<0.05)。与POH组相比，EPC组、pcDNA3.1-NC-EPC组和pcDNA3.1-HO-1-EPC组大鼠的血浆ANP、血清LDH、MDA、IL-17和TGF-β水平降低，SOD和CAT水平升高(P<0.05)。与EPC组相比，pcDNA3.1-HO-1-EPC组大鼠的血浆ANP、血清LDH、MDA、IL-17和TGF-β水平降低，SOD和CAT水平升高(P<0.05)。

表2 各组大鼠血浆ANP及血清LDH、SOD、CAT、MDA、IL-17和TGF-β水平Table 2 Plasma ANP and serum LDH, SOD, CAT, MDA, IL-17 and TGF-β in rats in each group

2.6 HO-1基因修饰的EPC对POH大鼠心肌组织中HO-1的mRNA和蛋白表达的影响

各组大鼠心肌组织中HO-1的mRNA和蛋白表达水平差异有统计学意义(mRNA：F=5 383.310，P<0.001；蛋白：F=385.777，P<0.001)。与假手术组相比，POH组大鼠中HO-1的mRNA和蛋白表达水平均降低(P<0.05)。与POH组相比，EPC组、pcDNA3.1-NC-EPC组和pcDNA3.1-HO-1-EPC组大鼠中HO-1的mRNA和蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与EPC组相比，pcDNA3.1-HO-1-EPC组大鼠中HO-1的mRNA和蛋白表达水平均升高(P<0.05，见图5)。

A.HO-1 mRNA相对表达量 B.Western blotting检测HO-1蛋白表达量与假手术组比较，* P <0.05；与POH组比较，#P <0.05；与EPC组比较，&P <0.05图5 各组大鼠心肌组织中HO-1 mRNA和蛋白表达水平Figure 5 HO-1 mRNA and protein expression levels in myocardial tissues of rats in each group

3 讨论

高血压可诱导心肌肥厚，进而导致心脏功能障碍[10]。严重的心肌肥厚可促进受损线粒体和错误折叠蛋白的过度累积，从而引起心力衰竭[11,12]。因此，抑制心肌肥厚已成为缓解高血压相关心力衰竭的重要治疗方向。神经体液系统的激活是导致高血压性心肌肥厚发生的重要机制之一，虽然多种神经体液因子拮抗剂已经应用于高血压的治疗中，但是仍然无法阻遏心脏向失代偿发展的趋势，因此急需要探索新的治疗策略。血管内皮功能不全是高血压及心肌肥厚的重要病理基础，血管内皮细胞功能障碍表现为扩血管物质分泌下降以及缩血管物质分泌增加，从而引起血压升高。内皮细胞损伤还可进一步促进炎症细胞浸润及间质细胞增殖，导致间质纤维化。因此，改善内皮细胞功能是高血压以及心肌肥厚防治的重要措施。EPC是一种多能干细胞，EPC可黏附到血管损伤区并分化为内皮细胞，同时诱导成熟内皮细胞迁移，促进血管新生和内皮更新。已有研究应用外周血源性EPC治疗心肌缺血再灌注大鼠，发现EPC降低了心肌梗死面积并提高了内皮功能[6]。然而，高血压状态下EPC功能下降将制约EPC移植后的作用。本研究对EPC进行了HO-1基因修饰，结果表明，HO-1基因修饰的EPC具有更强的迁移能力。由于高血压可降低EPC黏附、迁移能力[7]，本研究表明HO-1基因修饰的EPC具有更高的黏附和迁移能力，该结果为本研究的顺利开展打下了基础。

本研究中，与未进行基因修饰的EPC相比，HO-1基因修饰的EPC对POH大鼠血压及血流动力学参数具有更好的改善效果，表现为对SBP水平的降低和对EF和FS水平的升高。并且，HO-1基因修饰的EPC治疗的POH大鼠心脏损伤生物标志物(血浆ANP和血清LDH)水平更低。此外，与未进行基因修改的EPC相比，HO-1基因修饰的EPC明显降低了POH大鼠的心肌细胞直径和心肌纤维化面积，这些结果说明，HO-1基因修饰的EPC通过抑制POH大鼠心肌肥厚和纤维化提高了心脏功能并减轻了心脏损伤，并且其心脏保护作用优于EPC。

炎症和氧化应激是心肌肥厚和纤维化进展过程中必不可少的两个因素，两者相辅相成[13,14]。本研究表明，与未进行基因修饰的EPC治疗的POH大鼠相比，HO-1基因修饰的EPC治疗的POH大鼠血清膜脂质过氧化产物MDA及炎症因子IL-17和TGF-β水平降低，而抗氧化酶SOD和CAT水平升高，说明HO-1基因修饰的EPC提高了POH大鼠的抗氧化能力并抑制了炎症，其原因可能与HO-1的高抗氧化作用有关。机体中HO-1的分泌是一种重要的防御机制，可以抵抗各种损伤后组织和细胞的进一步氧化损伤[15]。在心肌肥厚的治疗中，许多药物是通过作用于HO-1基因网络来发挥治疗作用。例如，黄芪甲苷对大鼠心肌肥厚的保护作用部分是通过激活Nrf2/HO-1信号通路实现的[16]。还有文献指出，过表达HO-1可通过NF-kappaB依赖机制(一种炎症信号通路)抑制ROS诱导的心肌细胞肥大，纠正氧化还原平衡[17]。基于上述结果可知，对EPC进行HO-1基因修饰可能有助于提高EPC的抗氧化和抗炎功能，这也是其治疗心肌肥厚的主要机制。

综上所述，HO-1基因修饰的EPC具有更强的迁移能力、抗氧化和抗炎功能，从而在治疗POH大鼠心肌肥厚中发挥了更好的治疗效果。因此，HO-1基因修饰的EPC可能是治疗高血压相关心肌肥厚的一种潜在方法。