血清肿瘤标志物联合检测在原发性肝癌诊断中的价值研究

杨 结，谢万珍，刘树业

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率高，死亡率高，也是癌症死亡的常见原因之一，其发病率在消化系统的恶性疾病中居于第3位，仅次于胃癌及食管癌[1]。PLC病情进展快，临床治疗预后差，病死率高，每年大约有84万例肝癌新发患者，至少有78万人死于肝癌[2]。目前治疗肝癌的方法以手术治疗为主和结合介入治疗、局部治疗以及放化疗为辅的多学科治疗[3]，但由于肝癌患者被诊断时往往已发展为肝癌晚期，肿瘤解剖位置不佳、肿瘤过大、原发肿瘤数量多和肝外转移使其错过了最佳治疗的时机，预后往往很差[4]。因此，为实现早诊断早治疗，提高患者的生存率及生活质量，寻找早期诊断的方法就显得尤为重要。

肝癌的早期诊断包括病理、影像学、血清肿瘤标志物等手段，对于肿瘤体积较小的原发性肝癌患者，影像学检查漏诊率较高[5]；病理及临床症状在人体内的变化相对滞后，较血清标志物水平变化要晚数月到半年以上，容易延误病情；同时血清标本具有采集方便，并且检验过程操作简单、快速，费用低的优势，故而近年来，血清肿瘤标志物检测越来越多地运用到临床及科研中[6]。因此，血清标志物为肝癌的早期诊断提供了更多的参考指标[7]。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是最常用的血清肿瘤标志物，在肝癌的早期诊断和疗效评估上也有极其重要的作用，但仍有接近35%的PLC患者AFP检测结果呈阴性，其单项检测的敏感性和准确度还不能满足临床需要[8]。近年来，肿瘤标志物的联合检测已经逐渐应用到了肿瘤的诊断。AFP与其他肿瘤标志物的联合检测对于恶性肿瘤疾病的诊断也成为了首选。本研究对血清中甲胎蛋白AFP、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、癌抗原199(cancer antigen 199，CA199)、癌抗原724(cancer antigen 724，CA724)及细胞周期素A2（cyclin A2，CCNA2）联合检测在原发性肝癌诊断中的应用价值进行探讨，以期能为原发性肝癌的早期诊断提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取天津市第三中心医院2020年10月—2021年3月收治的经病理学和影像学明确诊断为PLC的患者72例为肝癌组，患者均为初次确诊，并且之前未经任何治疗。另选取同期住院的良性肝病患者80例设为肝良性疾病组，80例健康体检者为健康对照组。

1.2 纳入标准

1.2.1 正常对照组纳入、排除标准 年龄18～75岁，无恶性肿瘤，无呼吸系统、消化系统、循环系统、神经系统、运动系统、泌尿系统、内分泌系统、免疫系统疾病等慢性疾病。各项化验结果均在正常范围内。排除孕产妇、HIV阳性、恶性肿瘤史。

1.2.2 肝癌疾病组纳入、排除标准 年龄18～75岁，同时满足以下条件：1)具有肝硬化及乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV)感染(即HBV和/或HCV抗原阳性)的证据；2)肝脏占位直径≥2 cm，CT和MRI两项影像学检查中有一项显示肝脏占位具有肝癌的典型特征。或者同时满足以下条件：1)具有肝硬化以及HBV和/或HCV感染(即HBV和/或HCV抗原阳性)的证据；2)如果肝脏占位直径为1～2 cm，则需要CT和MRI两项影像学检查都显示肝脏占位具有肝癌的典型特征；3)血清AFP≥400 μg/L持续1个月或≥200 μg/L持续2个月，并能排除其他原因引起的AFP升高，包括妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及继发性肝癌等。或者典型的肝细胞癌影像学特征如下：同期多排CT扫描和/或动态对比增强MRI检查显示肝脏占位在动脉期快速不均质血管强化而静脉期或延迟期快速洗脱。

1.3 研究方法 所有患者均在治疗前采集5 mL清晨空腹静脉血，高速离心机3 500 r/min离心10 min，取上层血清，置于-20 ℃冰箱内冷藏待检。

CCNA2采用酶联免疫吸附法检测，试剂盒是美国Abcam公司生产。AFP、CEA、CA199和CA724通过全自动电化学发光免疫分析仪罗氏e801及其配套试剂进行检测。正常参考范围：1)AFP＜20 μg/L；2)CEA＜5 μg/L；3)CA199＜39 U/mL；4)CA724＜8.2 U/mL；5)CCNA2＜1295 pg/mL(注：本次数据经ROC曲线分析所得的诊断点)。若肿瘤标志物的检测数值高于上述正常参考值，则该项肿瘤标志物检测结果为阳性。

联合检测任意一项阳性即判断为阳性。敏感性=肝癌组检测阳性例数/肝癌组检测总例数×100%，特异性=良性组检测阴性例数/良性组检测总例数×100%，准确性= (肝癌组检测阳性例数+良性组检测阴性例数)/(肝癌组检测总例数+良性组检测总例数)×100%。

2 结果

2.1 肝癌组、肝良性疾病组及健康组血清肿瘤标志物水平比较 肝癌组血清AFP、CEA、CA199、CA724及CCNA2水平均显著高于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；肝癌组血清中AFP及CCNA2水平均显著高于肝良性疾病组，差异有统计学意义(P＜0.05)；肝癌组血清CEA、CA199及CA724水平与肝良性疾病组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 3组血清AFP、CEA、CA199、CA724与CCNA2水平比较

2.2 单项及联合检测对原发性肝癌临床诊断价值比较 血清肿瘤标志物AFP+CEA、AFP+CEA+CA199、AFP+CEA+CA199+CA724及AFP+CEA+CA199+CA724+CCNA2联合检测肝癌的敏感性、准确性与除AFP外的单项肿瘤标志物检测相比，均有所提高(P＜0.05)，其中AFP+CEA+CA199+CA724+CCNA2联合检测原发性肝癌的敏感性为63.2%、准确性为 74.6%，特异性为77.5%，见表2。

表2 血清肿瘤标志物单项及联合检测对原发性肝癌临床诊断价值比较

CA724单项检测的敏感度为100%，明显高于理论值。通过进一步ROC曲线分析本次数，得到本次数据分析中CA724的诊断点为1.485 U/mL，即本研究所收集的肝癌患者血清中CA724的浓度水平接近100%未超过CA724的实验室参考值（＜8.2 U/mL），导致研究结果敏感度偏高。推断可能原因为数据收集覆盖面不够，导致结果有倾向化趋势，另外可能由于本次研究涉及的CA724的临床参考值范围（＜8.2 U/mL）稍微偏高，导致单项检测结果阳性率偏高，以至于出现计算敏感度为100%的情况。

2.3 单项及联合检测ROC曲线分析 本研究中肝癌患者组血清 AFP、CEA、CA199、CA724与CCNA2各自单项检测及分别组合检测：包括AFP+CEA、AFP+CEA+CA 199、AFP+CEA+CA 199+CA 724及AFP+CEA+CA199+CA724+CCNA2联合检测对应的ROC曲线下面积有明显的上升趋势，且联合检测的准确度明显高于CEA、CA99、CA724以及CCNA2各自单项检测的准确度。五种血清标志物单项及联合检测的ROC曲线见图1，各检测指标及组合对应的曲线下面积柱状图见图2。

图1 血清AFP、CEA、CA199、CA724和CCNA2联合检测的ROC曲线

图2 血清AFP、CEA、CA199、CA724和CCNA2联合检测的曲线下面积

3 讨论

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，55%以上的PLC患者当出现典型的肝区疼痛等症状时[9]，已经错过了最佳治疗机会，且预后往往很差，因此PLC患者生存率的提高主要依赖于早期发现、早期诊断及早期治疗[10]。肿瘤标志物是指肿瘤发生过程中由肿瘤细胞直接或间接合成、分泌或其它组织所产生的化学类物质，是反映肿瘤存在的活性物质，它们有些不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，同时在肿瘤组织中的含量反而大大超过在正常组织里的含量，其在肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导方面具有重要的临床价值[11]。目前临床通过检测患者血清肿瘤标志物来筛查和辅助诊断各种恶性肿瘤已经受到越来越多的关注。理想的肿瘤标志物检测需要具备3个要素:敏感性高，尽早期检测出肿瘤患者；特异性好，区别肿瘤与非肿瘤患者，并且具有器官特异性[12]。本研究对血清中AFP、CEA、CA199、CA724及CCNA2标志物进行联合检测，以提高原发性肝癌的诊断率。

AFP 是起源于胚胎时期由卵黄囊合成的一种糖蛋白，在正常成年人的血清中含量极低。目前临床上AFP在原发性肝癌早期诊断具有十分重要的作用，是目前临床公认的肝癌特异性诊断指标[13]。也有研究表明，有些原发性肝癌并不分泌AFP，所以仅靠血清AFP的水平检测原发性肝癌，会出现漏诊的情况[14]。一般认为，对高风险肝癌患者来说，血清AFP超过500 μg/L（大多数实验室正常值为不超过20 μg/L）对PLC具有诊断性。然而，在接受筛查的患者中，PLC常在AFP处于更低水平时被诊断出[15]。Edoo等[16]研究表明，单项血清AFP检测在PLC早期诊断中的敏感性仅为63.3%，而AFP与CEA及CA199联合检测的敏感度接近100%，提示AFP单项检测的敏感性不足以满足临床需求。另有研究表明[17]，良性肝病患者体内AFP表达可呈一过性升高，易出现假阳性，使其临床应用受到限制。本研究结果显示AFP单项检测肝癌的敏感度为60.3%，而AFP与CEA及CA199联合检测的敏感度为72.3%。表明AFP单独检测的临床敏感性不能满足现有需求。

CEA是位于肿瘤细胞表面一种多糖蛋白复合物，是最早应用于恶性肿瘤诊断的标志物之一[18]。它属于广谱肿瘤标志物，包括原发性肝癌在内的多消化系统器官肿瘤中均可见CEA水平增高[19]。CEA主要经消化系统代谢，正常在血清中含量较低，一般参考值范围是0～5 μg/L，发生异常时可进入血液循环，导致血清CEA水平升高[20]。肝癌患者CEA的表达与癌细胞数量、转移及复发均密切相关，在大肠癌和胰腺癌等患者中CEA均有较高的阳性检出率[21]。有研究表明，血清CEA结合AFP、CA199的检测可以克服单一检测的不足，避免漏诊和误诊，显著提高PLC的阳性检测率[22]。本研究结果显示CEA单项检测肝癌的特异度为45%，准确度为59.9%，而CEA与AFP、CA199、CA724及CCNA2联合检测的特异度为77.5%，准确度为74.6%，相较于单项检测诊断效果有了显著提高。

CA199是消化系统肿瘤细胞分泌的相关抗原，在消化系统肿瘤诊断中有较高的应用价值。健康人血清CA199水平极低，常被用于诊断及监测胆管细胞型肝癌，但其临床价值目前也不限于肝细胞系统，还可以扩展到胃肠道癌症（如结肠直肠癌和食管癌）以及胃肠道以外的癌症[23]。Kim等[24]研究表明CA199单项检测升高的患者中76.6%并非为肝癌患者，提示CA199单项检测不能满足肝癌早期诊断的临床需要。Chen等[25]研究表明，AFP与CA199联合检测有助于在组织学检查前协助诊断肝细胞-胆囊癌，相较于CA199单项检测敏感度和特异度都有所提高。本研究结果表明CA199单项检测准确度为62.1%，而CA199与AFP、CEA、CA724及CCNA2联合检测的诊断准确度为74.6%，对肝癌诊断效果提升显著。

CA724是一种黏蛋白样高分子量糖蛋白，不仅存在于正常成人组织中,还可见于胚胎组织，其在正常人和良性疾病患者血清中的含量很低，是一种非特异性肿瘤标志物，该分子在肿瘤组织中的含量会明显增加且远远高于正常组织里的含量，其异常升高可以对肿瘤的组织发生、细胞分化以及细胞功能的诊断提供科学依据[26]。CA724在原发性肝癌的早期诊断中也具有重要的临床价值，但特异性较低，有研究表明，CA199、CEA和CA724可用作胃癌（GC）中的预后和监测工具，它们在较短的时间内进行联合测量是提高胃癌预后监测敏感度和特异性的最佳方法[27]。本研究结果表明，CA724对肝癌的单项检测特异度仅为34.4%，准确度为69.1%，而CA724与AFP、CEA、CA199及CCNA2联合检测的特异度为77.5%，准确性为74.6%，由此可证明，联合检测对肝癌的诊断效能有显著提升。

CCNA2是一种新型的肝癌血清标志物，将其引入肝癌诊断的肿瘤标志物组合之中，也是本研究的创新性之一。前期有研究得出CCNA2基因在HCC患者癌组织中表达水平上调，并可作为PLC预后不良的分子标志物的结论[28]。本研究进一步深入探究了血清CCNA2水平在肝癌诊断中的价值，同时进一步研究了CCNA2与其他四项常用肿瘤标志物联合检测的诊断效能。CCNA2是具有癌基因性质的细胞周期蛋白，在许多肿瘤中都过度表达，CCNA2在人类肿瘤中的表达可以预示肿瘤的生物学行为和临床结果[29]。Gao等[30]证明CCNA2在乳腺癌患者无转移生存、无病生存、无复发生存和总体生存方面具有重要的预测能力。Chen等[31]研究表明ESRP1蛋白水平与Ki-67增殖指数相关（r=-0.521；P＜0.01），并且ESRP1过表达明显抑制宫颈癌细胞增殖，并诱导G1期阻滞CCAN2的表达。本研究结果显示，血清CCNA2对于肝癌诊断的特异度为82.5%，相较于CEA、CA199、CA724的单项检测结果的特异性来说，具备了明显的优势，由此之后可以考虑将血清CCNA2纳入肝癌临床诊断常用的肿瘤标志物组合中。但CCNA2对于肝癌检测的敏感度仅为38.5%，准确度为60.5%，而与其他四项组合检测的敏感度为63.2%，准确度为74.6%，可见联合检测之后对于肝癌的诊断敏感度和准确度均有了明显提高。

本研究比较3组血清肿瘤标志物水平差异，结果显示原发性肝癌组患者AFP、CEA、CA125、CA199、CCNA2五项肿瘤标志物水平均显著高于健康组，这说明五项血清中肿瘤标志物均可作为原发性肝癌临床诊断的生化指标。然后比较五项血清肿瘤标志物单独检测和联合检测的敏感性、特异度与准确性。五项肿瘤标志物单独检测时，大多特异性较高，但敏感性较低。而联合检测相较于单项检测对于肝癌诊断来说，能显著提高敏感性。此结果说明，联合检测能够弥补单项肿瘤标志物的不足，提高原发性肝癌诊断的敏感性。然而，联合检测多个指标，由于联合诊断模型的选择，与单纯AFP相比，可能在诊断敏感性方面有了很大提高，但诊断的特异性方面有所降低，导致ROC曲线下面积稍逊于AFP。因此，联合检测可能在肝癌患者筛查方面稍有优势。