FSIP1促进乳腺癌细胞迁移和侵袭并导致患者不良预后

何伟丹 李志高

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，居女性恶性肿瘤死亡率的首位[1]。近年来乳腺癌的诊治取得了极大进步，其死亡率也逐渐降低[2]。早期乳腺癌的治疗主要采取外科手术和化疗。但对于中晚期及复发转移型乳腺癌，传统化疗常常诱发肿瘤耐药，治疗效果并不理想[3]。

目前以基因为切入点探究乳腺癌发生发展的分子机制已成为乳腺癌诊疗的新趋势，对于提高晚期乳腺癌患者的生存率具有十分重要的意义[4-5]。有研究提出，基因检测可作为制定早期乳腺癌治疗方案的辅助手段[6]。人表皮生长因子受体-2(HER2)是迄今为止研究比较透彻的乳腺癌基因之一[7]。纤维鞘相互作用蛋白1(Fibrous sheath interacting protein 1，FSIP1)是一种癌/睾丸抗原基因，在乳腺癌细胞中高表达。FSIP1可以与HER2结合，增强乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力[8]。然而，FSIP1在乳腺癌中的生物学作用尚未完全阐明[9]。本研究主要探究FSIP1在乳腺癌发生发展中的生物学作用，从细胞学层面为乳腺癌的治疗和研究提供一定的理论参考。

1 材料和方法

1.1 乳腺癌组织样本和病例资料收集

本研究选取2004年1月—2018年12月于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院确诊的404例乳腺癌患者癌组织和癌旁正常乳腺组织，收集的组织样本包括60例临床Ⅰ/Ⅱ期(14.85%)、118例Ⅲ期(29.21%)和226例Ⅳ期(55.94%)乳腺癌。病例入选标准如下：(1)女性，通过手术切检或穿刺活检病理确诊为乳腺癌，术后病理与穿刺病理结果不一致时以术后病理为准；(2)排除双侧乳腺癌、有其他肿瘤病史患者及拒绝参与者；(3)所有临床样本需经3名病理科医生独立诊断，癌旁组织需距癌组织切缘3 cm以上，镜下切缘检测确保切缘处无癌细胞或异型细胞。收集符合纳入标准患者的病例资料。收集的临床病例资料包括患者姓名、年龄、性别、婚育史、既往史、家族史、激素药物应用史、肿瘤的生长部位、肿瘤数目及形态、区域淋巴结转移情况、临床病理分期、肿瘤病理诊断、病理类型及分级、各项免疫组化指标、手术方式等情况。采取电话随访结合门诊复查病历资料的方式对入选患者进行随访，随访日期为2004年1月—2018年12月。患者术后第一天至其最终死亡时间或者到随访终止时间记为总生存时间(OS)。本研究经哈尔滨医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审批同意，标本库中存储的所有标本于实验展开前均已获得患者本人签署的知情同意书。

1.2 免疫组织化学

将石蜡包埋的乳腺癌及癌旁组织切片浸入二甲苯中以除去石蜡，然后用乙醇梯度重新水化。使用3% H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，采用柠檬酸钠法对组织切片进行抗原修复。抗原修复后的石蜡切片自然冷却至室温。随后用含有5%山羊血清的封闭液进行封闭，然后用抗FSIP1抗体(稀释比例为1∶200)在湿盒中4℃孵育过夜。用PBS洗涤后，将切片与HRP偶联的二抗(1∶500)在室温下孵育1 h。随后滴加DAB工作液进行复染，经梯度脱水后光学显微镜下观察染色结果。对染色结果进行评分，评分过程由3名副高职以上的病理科医生以盲评法完成。阳性染色细胞数<5%记为“阴性”。阳性染色细胞百分比评分：0分，阳性细胞数<5%；1分，阳性细胞数5%～25%；2分，阳性细胞数26%～50%；3分，阳性细胞数>50%。细胞染色强度评分：0分，阴性；1分，弱染色；2分，中染色；3分，强染色。总分数是由阳性比例得分乘以细胞染色强度得分所得出的最终得分(总分0～9分)。总分≥4的组织切片为FSIP1高表达，总分<4的则归为低表达[10]。

1.3 细胞培养和慢病毒转导

乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、SK-BR-3、T-47D及正常乳腺上皮细胞(HMECs)MCF-10A于含有10% FBS，100 mg/mL链霉素和100 IU/mL青霉素的RPMI-1640培养基中培养，并置于37℃、5% CO2培养箱内。每隔24 h更换培养液。采用CRISPR/CAS9技术对FSIP1高表达乳腺癌细胞系MDA-MB-231和SK-BR-3中的FSIP1基因进行敲除，慢病毒的转染参照说明书进行。GFP标记的CAS9-sgRNA作为阴性对照。

1.4 Western blot实验

收集经细胞培养的乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、SK-BR-3、T-47D和HMECs(MCF-10A)及敲除FSIP1基因的MDA-MB-231和SK-BR-3细胞系，加入RIPA裂解缓冲液进行处理，提取细胞中总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。根据不同浓度进行定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后采用湿转方法将蛋白转至PVDF膜上，5% BSA室温下封闭1 h。滴加一抗(稀释比例为1∶1 000)，4℃孵育过夜。经TBST彻底洗去未结合的一抗后再常温下孵育二抗(稀释比例为1∶5 000)1 h，经TBST充分洗膜后，加入ECL显影液完成显色，化学发光仪拍照记录。采用Image J进行蛋白定量分析，以各蛋白的灰度值与内参GAPDH的灰度比值进行蛋白定量分析。实验重复三次。

1.5 细胞迁移和侵袭分析

选取8 μm孔径的24孔Transwell小室评估乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力。预先在Transwell小室的底部加入200 μL Matrigel与无血清培养液的混合物并平铺于小室上层(按照1∶4稀释)，置于37℃孵箱孵育1 h以使其充分凝固。将敲除FSIP1的MDA-MB-231和SK-BR-3细胞系及对应的阴性对照组细胞消化后离心弃去培养液，使用无血清培养基重悬，并调整细胞密度至1×105/mL。顶部小室加入200 μL细胞悬液，在小室下槽加入600 μL含有10%血清的培养基，于37℃下孵育24 h 后，擦除小室上层未穿过膜的细胞，将底部小室中的细胞用甲醇固定、结晶紫染色，并用显微镜进行定量分析。实验重复三次。

1.6 统计分析

使用GraphPad Prism 7软件进行统计分析。计量资料数据采用均数±标准差表示，数据满足正态分布，且方差齐，组间比较使用配对t检验及单因素方差分析；FSIP表达与各临床病理参数的关系使用卡方检验进行分析；生存曲线用Kaplan-Meier方法绘制，生存曲线的比较通过Log-rank检验进行；OS的影响因素分析采用Cox比例风险回归模型，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FSIP1在乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中的表达情况

与HMECs(MCF-10A)相比，各乳腺癌细胞系中FSIP1蛋白的表达水平均显著升高(P<0.01)(图1A，B)。此外，采用免疫组化法对6对乳腺癌组织及其癌旁组织中FSIP1的表达情况进行检测，结果表明乳腺癌组织中FSIP1的表达水平明显高于癌旁正常组织(P<0.01)(图1C，D)。

图1 FSIP1在乳腺癌细胞系和癌旁正常组织中的表达情况Figure 1 The over-expression of FSIP1 protein in breast tumor tissues and breast cancer cell linesNote：A-B.The expression of FSIP1 in breast cancer cell lines and normal cell line was detected by Western blot；C-D.The expression of FSIP1 in 6 pairs of breast cancer and adjacent non-cancerous tissues was detected by IHC.**P<0.01，compared with the HMECs or paratumor tissue.

2.2 FSIP1过表达与患者OS的关系

与FSIP1低表达乳腺癌患者相比，FSIP1高表达乳腺癌患者OS显著缩短(中位OS：73个月vs.82个月，P<0.001)(图2)。通过多因素Cox回归将FSIP1与患者年龄、TNM分期纳入回归分析中，结果显示FSIP1高表达可作为OS的独立危险因素(HR=2.39，95%CI：1.88～3.05，P<0.001)。

图2 在乳腺癌患者中FSIP1高表达与肿瘤恶性程度和较短的总生存期有关Figure 2 The high expression of FSIP1 protein was correlated with shorter overall survival of breast cancer patients

分析乳腺癌患者肿瘤组织中FSIP1表达水平是否与患者临床疾病分期的有关，结果显示FSIP1高表达与乳腺癌患者临床分期较高有关(表1)(P<0.001)，同时FSIP1高表达与细胞增殖标记物Ki-67高表达有关(P<0.001)(表1)。

表1 乳腺癌患者FSIP1表达与临床特征的关系[n(%)]Table 1 Basic information scale for patients[n(%)]

2.3 FSIP1对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

为了进一步阐明FSIP1的致癌功能，Western blot结果显示敲除FSIP1基因后乳腺癌细胞系MDA-MB-231和SK-BR-3中FSIP1蛋白表达显著降低(P<0.01)(图3A)。

细胞迁移和侵袭实验结果显示，敲除FSIP1基因后乳腺癌细胞系MDA-MB-231和SK-BR-3的迁移和侵袭能力显著降低(P<0.01)(图3B-3D)。

图3 敲除FSIP1基因对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响Figure 3 The FSIP1 gene knockout attenuated capabilities of migration and invasion in cancer cellsNote：A.The FSIP1 gene knockout was confirmed in MDA-MB-231 cells and SKBR3 cells by Western blot；B.The results of cell migration and invasion in MDA-MB-231 cells and SKBR3 cells；C and D.The results of statistical analysis for cell migration and invasion in MDA-MB-231 cells and SKBR3 cells.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(n=3).

3 讨论

目前对于中晚期以及复发转移型乳腺癌仍然缺乏有效的治疗手段[11]，深入探究乳腺癌的致病机理以及对应的分子生物学机制，对于提高晚期乳腺癌患者的生存率至关重要[12-13]。FSIP1是最初在酵母双杂交筛选中发现并鉴定的一种肿瘤睾丸抗原，其表达倾向于睾丸组织并在肿瘤细胞中重新激活并赋予细胞有丝分裂稳健性[14]。研究表明，FSIP1在乳腺癌细胞中高表达，并且能够调节乳腺癌细胞自噬[15]，通过促进自噬增强了对多西他赛等化疗药物的敏感性[16]。FSIP1可直接结合HER2胞内结构域以促进乳腺癌进展[8]。然而，目前对于FSIP1在乳腺癌中的作用机制仍不完全清楚，其在乳腺癌中的生物学作用及影响仍有待进一步的研究与探讨。

在本研究中，通过免疫组化及Western blot实验检测发现乳腺癌组织及细胞中的FSIP1显著高表达。为探究FSIP1高、低表达是否与乳腺癌患者临床病理特征有关，对404例既往就诊于我院的乳腺癌患者组织切片中FSIP1的表达水平进行检测并回顾性分析患者的病例资料，结果显示晚期乳腺癌患者的FSIP1表达水平明显较高，并且高表达FSIP1的乳腺癌患者常伴随较短的OS。同时也验证了FSIP1高表达与细胞增殖标志物Ki-67的阳性率相关。以上结果表明，FSIP1在乳腺癌组织及细胞中高表达，并且与乳腺癌患者的不良预后密切相关。

细胞的癌变及恶性转化是一个多步骤的过程。乳腺癌干细胞驱动乳腺癌的原始致癌性、局部侵袭和迁移倾向，并且具有自我更新、多向分化和增殖潜能[17]。乳腺癌细胞需要重新编程能量代谢，对生长抑制信号不敏感，不受限制的生长信号，无限的复制潜能，细胞凋亡，逃避免疫检测，组织侵袭和转移以及持续的血管生成，共同促进了细胞的癌变及进展过程[18-20]。为进一步探究FSIP1在乳腺癌中的生物学功能，本研究采用基于CRISPR/CAS9的慢病毒技术敲除两个具有高内源性FSIP1表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和SK-BR-3细胞中的FSIP1基因，并通过Western blot实验对敲除结果进行验证。通过迁移实验和侵袭实验进一步证实，敲除FSIP1的乳腺癌细胞其迁移和侵袭能力明显低于对照组。这些实验充分说明了敲除FSIP1基因能够显著降低乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，从而证明FSIP1基因在促进乳腺癌的发生发展中起到关键作用。

综上所述，本研究通过实验发现了FSIP1是乳腺癌潜在的促癌基因，其在乳腺癌组织中表达显著高于癌旁组织，并且与乳腺癌患者恶性程度相关，导致患者不良预后。有望成为评估乳腺癌患者预后的独立生物标志物以及乳腺癌治疗中潜在的分子靶点。乳腺癌的治疗任重而道远，我们需要更为深入地探究乳腺癌发生发展的生物学机制并为开展针对乳腺癌靶向治疗的新药研究奠定理论基础，从而为乳腺癌的治疗提供新策略。