慈莲胶囊对增生乳腺组织凋亡通路的影响

刘彦恒 代志坚 张萌 李峰 夏瑶宾

【关键词】乳腺增生;慈莲胶囊;凋亡通路;修复

中医学将乳腺增生病多称为“乳癖”，多因情志不畅，肝气郁结，气滞不舒，气血周流失度，气滞血疲挟痰，导致乳络经脉阻塞不通，结聚乳中为肿块则引起乳房疼等症候[1]。内蒙古自治区中医医院肿瘤科，观察临床发病率发现气滞痰凝型居多，故在原经验方“慈莲丸”的基础上加味调整，拟定并制备了中藥慈莲胶囊，其以气滞血疲痰凝为本，治疗上重在疏肝行气、化痰祛疲、散结止痛，同时佐以补肾调摄冲任，方中柴胡、青皮、丹参疏肝行气、活血化疲为君，山慈菇、半枝莲化痰软坚散结为臣，鹿角霜补肝肾、调摄冲任，诸药合用共奏行气活血、化痰散结。经临床验证，该基本方具有疏肝行气、活血祛疲、化痰散结之功效[1]。临床及药理试验研究提示其参与性腺轴、激雌激素信号通路及免疫失衡调节[2] ，HE染色乳腺组织形态表明，与模型组比较其对过度增生有明显的抑制作用，推测其可能参与增生细胞凋亡环节，促进其凋亡，抑制组织过度增生并修复乳腺组织结构。为阐明其疗效机制，本文通过建立大鼠乳腺增生模型，来观察慈莲胶囊对凋亡途径的影响。

细胞程序性死亡可分为外源性与内源性，外源性细胞凋亡，可由Fas和TNF受体等死亡受体介导，如Fas的配基（Fast）与Fas结合后，能够激活凋亡因子caspase-8，次第激活caspase-3，终致细胞程序性死亡。内源性细胞凋亡，线粒体膜的通透性受外界刺激而改变，即而释放出的细胞色素c招募其他凋亡因子形成凋亡体，从而激活caspase-9，次第激活caspase-3，终致细胞凋亡[3]。

fas广泛分布于活化T.B细胞及单核细胞表面，广泛表达于正常组织及肿瘤细胞上。fasl即fas配体是肿瘤坏死因子家族的细胞表面分子，仅表达于活化T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞以及免疫豁免部位及其他上皮。caspa家族是细胞启动凋亡程序的关键，属于半耽氨酸蛋白酶（caspa、家族）的caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。Fasl、fas和caspase3参与细胞程序性死亡。fas是靶细胞膜上的重要的死亡受体，免疫细胞上fasl与fas结合，活化并向靶细胞传导死亡信号[3]，在靶膜内部caspase3接受到从fas传到的死亡信号，开始执行外源性细胞凋亡程序。而乳腺组织周围有着丰富的淋巴网和毛细血管网，T淋巴细胞可以通过淋巴网和毛细血管网到达乳腺组织附近触发内外源性凋亡机制使增生的乳腺细胞发生凋亡反应，而起到保护和修复作用。

1 材料

药品慈莲胶囊（内蒙古自治区中医医院制剂中心提供，批号180307，内药制字Z16010006）;兽用苯甲酸雌二醇注射液（宁波第二激素厂生产，批号20180420）;黄体酮注射液（宁波第二激素厂生产，批号180225）;夏枯草胶囊（规格32 克/瓶，有效期36 个月，聚协昌北京药业有限公司，20180101 生产，国药准字210207747）;他莫昔芬片（四川迪菲特药业有限公司，批号1706020）。动物SPF级雌性wistar未孕大鼠，9 周龄，购于内蒙古大学生命科学院，合格证号SCXK（内）2018-0090。

2 研究方法

2.1 造模

雌性大鼠肌内注射苯甲酸雌二醇0.5 mg·kg-1，1 次/d，连续25 d，其后用黄体酮肌注4 mg·kg-1，1 次/d，连续5 d。造模后光镜下观察大鼠乳腺组织结构及形态，根据乳腺增生大鼠模型病理诊断标准 ，造模成功依据为乳腺小叶增生和导管扩张。

2.2 分组及给药

造模成功后，将大鼠随机分为7 组，即西药对照三苯氧胺组、中药对照夏枯草组、慈莲胶囊高，中、低剂量组，正常组、模型组。慈莲胶囊的临床应用剂量按成人60 kg 人每日4 g，相当于生药0.95 g，大鼠每日给药量分别为低（A组）0.063，中（B组）0.316，高（C组）0.632 g·kg-1·d-1;夏枯草组（E组）0.023 g·kg-1·d-1;三苯氧胺组（D组）0.018 g·kg-1·d-1。正常组（G组）、模型组（F组）（以等量水灌胃）：各组每日灌胃1 次，连续28 d。大鼠末次给药后禁食不禁水12 h， 腹腔内注射20% 乌拉坦麻醉大鼠。

2.3 乳腺标本取材与观察指标

楔形取下大鼠第2对双侧乳房，用免疫组化技术检测各组大鼠乳腺组织中 凋亡蛋白（Fas）和凋亡蛋白配体（Fasl）、抗凋亡基因（survivin）与促凋亡基因（caspase-8）的表达。

2.4 免疫组化法

取材、固定，将固定后的组织用水冲洗，去除残留的液及杂质。不同浓度的乙醇每级2 h，50%、70%、85%、95%、无水乙醇逐级脱水。纯乙醇和二甲苯的等体积混合液中置入组织块2 h，浸入纯二甲苯2 h×2次;置恒温箱中，先将组织块浸入熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液，浸渍1～2 h，再先后2 次浸渍于熔化的石蜡液约3 h×2次。包埋后切片，约为4～7 μm。烤片、脱蜡、水化，置于0.01 M 柠檬酸钠缓冲溶液中，高压修复15 min，室温冷却后，以0.02 M PBS 洗3 min×3 次。消除内源性过氧化物酶的活性，将玻片置于3% H2O2中，于湿盒孵育10 min，以0.02 M PBS 冲洗3 min×3次。一抗孵育：滴加一抗，湿盒孵育，室温下放置1 h。0.02 M PBS冲洗3 min×3次。加入HRP，标记广谱二抗，湿盒孵育，室温下放置20 min～30 min。以0.02 M PBS冲洗3 min×3次。DAB染色后，以苏木素复染3 min，1%盐酸酒精分化，显微镜下观察控制染色程度。水冲洗10 min，放入65℃烘箱中烘干。将玻片置于二甲苯中透明3 min×2次，中性树胶封片，置65℃烘箱中15 min烘干。在显微镜下观察样本并采集，计算阳性面积。

3 结果

凋亡因子在乳房组织的表达（见表1，图1～图6）。Fas阳性分布值A组明显高于F、G、E组，与D组相似;FasL阳性分布值A组明显低于F、E，与G、D组相似;caspase-8阳性分布值A组明显高于F组、E组、G组、D组;survivin阳性分布值A组明显低于F组、E组，G组于、D组相似。

4 讨论

本研究提示慈莲胶囊治疗乳腺增生症与激活免疫细胞与增生乳腺细胞之间的fas、fasL和caspase-8介导信号通路有关，在此干预的过程中上调fas、caspase-8的表达，并下调了Fasl蛋白的表达，使其表达量接近或低于正常的乳腺组织，具有活性的caspase-8可引发caspase级联反应介导细胞凋亡、可激活线粒体途径凋亡通路和参与内质网途径。survivin独特性表现为在有丝分裂时呈细胞周期依赖性表达，通过抑制caspase-3 和caspase-7来抑制多种凋亡触发因子诱导的细胞凋亡，以确保细胞周期G2/M期正常分裂促进细胞周期进展[5]。在XIAP BIR域存在的情况下，survivin与所有胱天蛋白酶caspase-3，caspase-7和caspase-9强烈相互作用[6]。慈莲方下调了Survivin的表达，进而促进了细胞凋亡发生。提示慈莲胶囊通过参与多个凋亡通路环节抑制了乳腺增生的发展，促进了过度增生细胞凋亡的过程，发挥抗增生和修复作用。