哈尼族药秦盾胶囊微生物限度检查方法的建立

付开聪 崔明筠 彭霜

摘要：目的建立哈尼族药秦盾胶囊微生物限度检查方法。方法按照2020年版《中国药典》通则1105、1106、1107，采用常规法、薄膜过滤法、增加稀释液法、增加培养基体积法、同时增加稀释液和培养基体积法进行方法适用性试验，计算各试验菌回收比。结果薄膜过滤法、增加培养基体积法、同时增加稀释液和培养基体积法3种方法各试验菌回收比值均在0.5～2.0范围内，结果符合2020年版《中国药典》，其中增加培养基体积法结果优于其他方法;控制菌检查中，阳性对照组检出阳性菌，试验组和阴性对照均无菌落生长。结论通过方法适用性试验，所建立微生物限度检查方法适用于哈尼族药秦盾胶囊的微生物限度检查。

关键词：秦盾胶囊;微生物限度检查;民族药;培养基

中图分类号：R285.5  文献标志码：A  文章编号：1007-2349（2022）06-0065-05

秦盾胶囊是普洱市民族传统医药研究所在挖掘整理哈尼族医药过程中，整理得到的哈尼族验方，主要由秦皮、倒心盾翅藤等组成，有清热、利尿、散瘀、除湿、止痛的作用。前期研究表明，秦盾胶囊有较好的黄嘌呤氧化酶抑制活性，具有较好的安全性，该方在当地临床使用中疗效显著，副作用低，早期痛风患者服用该药后两月基本恢复正常，部分典型痛风晚期病例服用1～2个疗程后，尿酸有明显降低，能够有效改善尿酸高引起的痛风，缓解患者痛苦[1]。

秦盾胶囊内含中药原粉，在原辅料、生产工艺及环境等可控因素下，药材的土壤、水源、运输、加工、储藏等多个环节也可能增加污染风险，从而导致制剂微生物污染菌的检出[2]。为了更好地控制其质量，保证临床用药安全，本试验按照2020年版《中国药典》相关要求，通过方法学适用性试验建立秦盾胶囊微生物限度检查方法，更好地控制药品质量和安全，以期为后续的民族药制剂研究提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 SW-CJ-2FD型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、手提式压力蒸汽灭菌锅（新华医疗器械股份有限公司）、DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海锦凯科学仪器有限公司）、Scout系列电子天平（奥豪斯仪器有限公司）、HHWS-Ⅱ-250型恒温恒湿培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）、新华牌121℃压力蒸汽灭菌化学指示卡（山东新华医疗器械股份有限公司）、CYW-300B型微生物限度检测仪（杭州川-实验仪器有限公司）、玻璃培养皿、灭菌桶、三角瓶、试管、药匙、一次性无菌滴管（独立包装）、酒精灯等。

1.2 培养基与试药 胰酪大豆胨液体培养基TSA（批号：1090951）、胰酪大豆胨琼脂培养基TSB（批号：1090991）、沙氏葡萄糖琼脂培养基SDA（批号：1080971）、肠道菌增菌液体培养基（批号：1082851）、麦康凯液体培养基（批号：1087341）、RV沙门菌增菌液体培养基（批号：1090811）等，上述培养基均由广东环凯微生物科技有限公司提供，培养基适用性检查结果均符合2020版《中国药典》四部项下规定。pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：150526，北京三药科技开发有限公司），秦盾胶囊（普洱市民族传统医药研究所制，批号：20210901、20210902、20210903）、纯化水、75 %乙醇消毒液等。

1.3 菌种 金黄色葡萄球菌（G0004B）、铜绿假单胞菌（F0042B）、黑曲霉菌（F0041B）、枯草芽孢杆菌（F0058B）、大肠埃希菌（D0069DX）、白色念珠菌（G0012B），上述菌种均购自广东环凯微生物科技有限公司，经鉴定合格，本试验所用均为第三代菌种。

2 方法与结果

2.1 秦盾胶囊微生物限度检查方法

2.1.1 检验依据 由于秦盾胶囊内含有中药原粉，照2020年版《中国药典》四部制剂通则（0103）胶囊剂和通则（1100）生物检查法项下要求，固体口服给药制剂不含豆豉、神曲等发酵原粉需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌应符合非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准。按微生物计数法（通则1105）、控制菌检查法（通则1106）及非无菌药品微生物限度标准（通则1107）方法及要求，进行方法适用性试验，建立秦盾胶囊微生物限度检查方法，结果应符合要求。

2.1.2 菌液制备 参照相关制剂微生物限度检查方法[2-5]，在檢验开始前，先取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌几种菌种分别接种于对应的做好标记的培养基中，在适宜条件下培养一定时间，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别将上述各菌种的培养物稀释成含菌数约50～100 cfu/mL的菌液，作为阳性对照菌液，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 参照文献相关检查方法[2]，取3个批次的秦盾胶囊，从每个批次中随机抽取3个样品，打开外包装，编号，将内包装消毒后置于生物安全柜内，打开生物安全柜，精密称取每个样品的秦盾胶囊10 g，加无菌胰酪大豆胨液体培养基TSB至100 mL，待囊壳和内容物全部溶解后，混匀，制成1∶10的供试液，即第一梯度。取上述供试液1 mL加到9 mL的无菌胰酪大豆胨液体培养基中，制成1∶100的供试液，作为第二梯度，同法制成1∶1000 的供试液，作为第三梯度，标记好，备用[3-5]。

2.1.4 需氧菌检查方法考察

2.1.4.1 常规法 将本实验分为3组：（1）试验组：精密吸取“2.1.2菌液制备”项下菌液0.1 mL，加到9.9 mL的第一梯度供试液中，作为试验组溶液;（2）供试品组：精密吸取0.1 mL稀释液，加入9.9 mL的1∶10第一梯度供试液中，混匀，作为供试组溶液;（3）阳性菌对照组：精密吸取0.1 mL菌液，加入9.9 mL稀释液中，混匀，作为阳性菌液对照组溶液[6-9]。

接种：分别吸取上述三组溶液1 mL，分别注入平皿中，照2020年版《中国药典》通则1105，分别加入15～20 mL 45℃左右的胰酪大豆胨琼脂培养基TSA和沙氏葡萄糖琼脂培养基SDA，混匀，凝固，每组制备1个相同的平行对照皿，放入相应的恒温恒湿培养箱中倒置培养，计算平均菌落数。

2.1.4.2 薄膜过滤法 精密吸取“2.1.4.1常规法”项下3个实验组溶液各1 mL，至100 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中过滤冲洗，每组冲洗三次，每次100 mL，然后将滤膜取下，菌面朝上贴于相应的培养基上，放入培养箱，在适宜的条件下培养，测定菌落数[2]。

2.1.4.3 增加稀释液法 参照常规法，精密吸取“2.1.2菌液制备”项下菌液0.1 mL，加入9.9 mL制备好的1∶100和1∶1000的秦盾胶囊供试液中，混匀，作为试验组溶液，分别精密吸取制备好的试验组溶液1 mL，注入培养皿中，加入15～20 mL温度不超过45 ℃熔化的TSA或SDA培养基，混匀，凝固，每组制备1个相同的平行对照皿，标记好放入相应的恒温恒湿培养箱中倒置培养，计算平均菌落数[2]。

2.1.4.4 增加培养基体积法 取制备好的菌液0.1 mL，加入到9.9 mL的1∶10供试液中，混匀，作为试验组，分别吸取0.5 mL和0.2 mL注入培养皿中，倒入15～20 mL温度不超过45 ℃熔化的TSA和SDA培养基，混匀，凝固，每组制备1个相同的平行对照皿，标记好放入相应的恒温恒湿培养箱中倒置培养，计算平均菌落数。

2.1.4.5 同时增加稀释液和培养基体积法 吸取菌液0.1 mL，分别加入9.9 mL的1∶100和1∶1000的供试液中，混匀，作为试验组溶液，分别吸取制备好的溶液0.2、0.4、0.5 mL注入培养皿中，加入15～20 mL温度不超过45℃的TSA和SDA培养基，混匀，凝固，每组制备1个相同的平行对照皿，标记好放入相应的恒温恒湿培养箱中倒置培养，计算平均菌落数。

2.1.5 回收比计算 回收比计算按下列公式计算：试验组菌落数回收比：（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数。稀释液菌落数回收比：（试验组平均菌落数-稀释剂对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数

2.1.6 考察结果

2.1.6.1 常规法计数结果 本次试验在相关文献基础上，用常规法考察了常见中药材的几种菌的回收比，为了使结果更加准确，每个批次测定3次，结果见表1。

根据上述表1常规法测定结果可知，9个试验组各菌株的回收比未完全在0.5～2之间，其中，4组样品中金黄色葡萄球菌的平均回收比偏高，同时9组样品的金黄色葡萄球菌的平均回收比均低于0.5，9组样品中有7个白色念珠菌回收比低于0.5，说明秦盾胶囊对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有较强的抑制作用，本次试验选用金黄色葡萄球菌和白色念珠菌作为需氧菌总数计数测定的敏感菌株。霉菌、酵母菌计数时，得到的各试验菌的平均回收比在0.5～2.0之间，说明试验符合2020年版《中国药典》四部要求，可用常规法进行检查。

2.1.6.2 秦盾胶囊微生物检查敏感菌适用性考察 结合相关文献，根据常规法计数结果，以金黄色葡萄球菌和白色念珠菌为敏感菌，按照“2.1.4.2”、“2.1.4.3”、“2.1.4.4”、“2.1.4.5”项下方法进行试验，每个批次样品做3次，通过比较四种方法得到的回收比，确定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数方法。结果见表2。

由表2秦盾胶囊微生物检查敏感菌回收比结果可知，敏感菌株回收比差异明显。其中，金黄色葡萄球菌计数结果中，增加稀释液法（1∶100）组有3个样品平均回收比低于0.5，说明当供试液浓度为1∶100时，对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用;薄膜过滤法、增加培养基体积法、同时增加稀释液培养基体积法三种方法所得平均回收比均在0.5～2.0之间，且增加培养基体积法（0.2 mL/皿）菌株平均回收比优于其他方法，故选择增加培养基体积法进行秦盾胶囊需氧菌计数检查。

2.1.6.3 需氧菌检查方法适用性验证 根据常规法计数结果及敏感菌适用性考察，选用增加培养基体积法对3个批次秦盾胶囊进行需氧菌检查方法适用性试验验证，按“2.1.4.4增加培养基体积法”项下进行操作，计数结果见表3。

根据表3秦盾胶囊微生物检查适用性验证结果可知，3个批次9组样品的秦盾胶囊5种菌株平均回收比均在0.5～2.0范围内，符合2020年版《中国药典》相关要求，确定以增加培养基体积法测定温度胶囊需氧菌总数，方法可行。

2.2 秦盾胶囊控制菌检查 根据“2.1.1检验依据”项下《中国药典》对非无菌含药材原粉制剂的微生物限度检查要求，照通则1106项下控制菌检查方法分别对秦盾胶囊中耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌进行检查。

2.2.1 耐胆盐革兰阴性菌 照分别吸取“2.1.3供试品溶液制备”项下各样品1∶10的供试液各1 mL加入9 mL的肠道菌增菌液体培养基中，作为供试品试验组。同法分别吸取各样品1∶10供试品溶液各1 mL加入到9 mL的肠道菌增菌液体培养基中，并加入0.1 mL“2.1.2菌液制备”项下的大肠埃希菌液和铜绿假单胞菌液，作为阳性菌对照组。再取1 mL胰酪大豆胨液体培養基加入到9 mL的肠道菌增菌液体培养基中，作为阴性对照组。

2.2.2 大肠埃希菌 分别吸取1mL “2.1.3供试品溶液制备”项下各样品的1∶10的供试品溶液加入到9 mL麦康凯液体培养基中，作为供试品试验组;同法吸取1mL各样品1∶10的供试品溶液加入到9 mL的麦康凯液体培养基中，并加入0.1mL “2.1.2菌液制备”项下大肠癌抑菌液，作为阳性菌对照组;再吸取1 mL胰酪大豆胨液体培养基加入到麦康凯液体培养基中，作为阴性对照组。

2.2.3 沙门菌 分别吸取1 mL“2.1.3供试品溶液制备”项下各样品1∶10的供试品溶液，加入到9 mL RV沙门菌增菌液体培养基中，作为供试品试验组;同法吸取1 mL各样品1∶10的供试品溶液加入到9 mL RV沙门菌增菌液体培养基中，并加入0.1 mL“2.1.3菌液制备”项下乙型副伤寒沙门氏菌液，作为阳性菌对照组;吸取1 mL胰酪大豆胨液体培养基加入到9 mL的RV沙门菌增菌液体培养基中，作为阴性对照组。

2.2.4 控制菌检查结果 将上述制备好的培养基放入恒温恒湿培养箱中，在适宜条件下培养并观察记录，秦盾胶囊控制菌检查结果见表4。

本次试验采用常规法对秦盾胶囊控制菌进行检查，从表4控制菌检查方法适用性结果可以看出，各试验组和阴性对照组均无菌落生长，而阳性对照组都检出了阳性菌，说明可以用本试验方法可用于秦盾胶囊控制菌的检查。

3 讨论

有研究表明，药品微生物限度检查容易受到来自各种因素的影响[10]，包括药品原辅料的采集、包材、生产工艺、设施、环境、人员等方方面面，是客观衡量药品质量的重要指标[11-13]。为了建立针对秦盾胶囊影响小，操作简单，结果准确，效率高的微生物限度检查方法，本试验进行了方法适用性试验，并对其可靠性和可行性进行了分析和验证。

在对秦盾胶囊需氧菌、霉菌酵母菌检查试验中可以看出，哈尼族药秦盾胶囊具有一定的抑菌作用，在进行微生物限度检查的过程中，应先消除其本身对细菌的抑制作用，保证被检查的微生物正常的生长和繁殖[2，12]。通过查阅相关非无菌含中药原粉制剂文献及研究[13-15]，本试验首先采用常规法对各类需氧菌进行考察，发现秦盾胶囊对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌较为敏感，有较强的抑制作用。故分别采用薄膜过滤法、增加稀释液法、增加培养基体积法、同时增加稀释液和培养基体积法对其进行适用性试验并进行验证，当稀释液浓度为1∶100时，对敏感菌仍然具有抑制作用，而薄膜过滤法、增加培养基体积法及同时增加稀释液和培养基体积法三种方法所得到菌株平均回收率均在0.5～2.0之间，说明这3中方法对细菌抑制作用基本消除，3种方法中，增加培养基体积法（0.2 mL/皿）菌株回收比优于其他方法，最终选择增加培养基体积法进行下一步试验，通过验证，结果符合《中国药典》相关要求。

在对秦盾胶囊控制菌检查试验中，通过查阅相关资料及文献，采用了常规法对其检查，不同批次样品检出结果基本一致，阳性对照组均有菌落生长，也说明本方法对控制菌的抑菌作用基本没有，适用于对    哈尼族药秦盾胶囊的控制菌检查。具有操作简单、误差较小、成本低，微生物污染风险小等特点。

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（收稿日期：2022-02-16）