Beclin-1、Bax及周期蛋白依赖性激酶4蛋白在子宫内膜癌中的表达及其临床意义

谢田凤 杨进琼 陈秀芬

[摘要]目的探讨Beclin-1、Bax及周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）蛋白在子宫内膜癌（EC）中的表达及其临床意义。方法选取高州市人民医院2019年1月至2021年6月收治的42例EC患者作为观察组，选取同期高州市人民医院58例子宫肌瘤患者作为对照组，两组患者均进行子宫切除术，获取两组病灶组织标本，采用Westernblot法检测并比较两组患者病灶组织Beclin-1、Bax、CDK4蛋白相对表达量，分析Beclin-1、Bax、CDK4在不同病理特征EC患者中表达的差异情况。结果观察组的CDK4表达水平高于对照组，观察组的Bax及Beclin-1水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。低、未分化程度、FIGO分期III～IV期、有淋巴结转移、肌层浸润≥1/2患者的CDK4表达水平高于中、高分化程度、FIGO分期I～II期、无淋巴结转移、肌层浸润<1/2的患者，低、未分化程度、FIGO分期III～IV期、有淋巴结转移、肌层浸润≥1/2患者中Beclin-1及Bax表达水平低于中、高分化程度、FIGO分期I～II期、无淋巴结转移、肌层浸润<1/2的患者，差异有统计学意义（P<0.05）。结论EC患者病灶组织的Beclin-1、Bax及CDK4与子宫肌瘤患者存在明显差异，Beclin-1、Bax及CDK4可作为评估EC患者预后的指标。

[关键词]Beclin-1;Bax;周期蛋白依赖性激酶;子宫内膜癌

[中图分类号]R737.33

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616（2022）11-0147-04

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是一种起源于子宫内膜上皮的恶性肿瘤，目前研究显示[1]，EC占女性生殖系统恶性肿瘤患者总数的20%～30%，且发病率呈逐年上升及年轻化的趋势，对我国女性生命健康构成严重威胁。目前主要采用手术治疗EC，但部分患者术后复发且复发患者生存期较短，对EC进行早期诊断及干预具有重要意义。随着分子医学的不断发展，目前发现在EC患者中存在多种因子的异常表达，其中Beclin-1、Bax及周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinases，CDK4）属于凋亡基因编码蛋白家族成员[2]，通过促进肿瘤细胞增殖、参与细胞自噬过程及肿瘤细胞凋亡抑制等在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。本研究中对EC患者的Beclin-1、Bax及CDK4的相對表达水平进行检测，分析其在子宫内膜恶性肿瘤及良性肿瘤中的差异情况，同时分析其在恶性肿瘤患者中表达的差异情况，为临床提供参考。

1资料与方法

1.1一般资料

选取高州市人民医院（我院）2019年1月至2021年6月收治的42例EC患者作为观察组，选取同期我院收治的58例子宫肌瘤患者作为对照组，观察组年龄32～68岁，平均（47.6±3.5）岁;体重指数（body mass index，BMI）18.21～28.54kg/m2，平均（21.75±1.06）kg/m2;分化程度：低、未分化21例，中分化11例，高分化10例;病理分期：I～II期35例，III～IV期7例，子宫内膜厚度4～24mm，平均（16.21±2.35）mm。对照组年龄31～67岁，平均（47.2±3.0）岁;BMI17.52～29.56kg/m2，平均（21.60±1.04）kg/m2。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

纳入标准：1经我院影像科、病理科检查，确诊为EC或子宫肌瘤，其中子宫肌瘤患者子宫内膜组织正常;2拟行腹腔镜下子宫全切术治疗。排除标准：1合并心、肝、肾等重要脏器功能障碍者;2合并神经系统、内分泌系统、消化系统严重疾病者;3入组前接受过放化疗治疗者。

1.2方法

留取两组患者术中病灶组织送病理学检查，加入RIPA裂解液后进行充分匀浆，匀浆次数15次，匀浆时间为30min，获取匀浆悬浮液，置于新型单温区冷藏冷冻设备（北京福意电器有限公司，型号：FYL-YS-129A型），在4°C的条件下保存1h。使用离心机（美国贝克曼公司，型号：OptimaMAX-TL型）离心10min，离心速度为15000r/min，离心半径为15cm，提取上清液，获取总蛋白。行SDS-PAGE电泳、转印，先使用70V恒压进行分离胶后调至100V，使用湿转移法转移蛋白，使用280mA恒定电流转模50min，脱脂奶粉（加入1×TBST10ml与0.5g脱脂牛奶干粉进行震荡充分溶解）进行封闭，封闭条件：37°C，1h，而后使用PBST洗膜3次，10min/次;加入兔抗Bax（稀释浓度1∶2000，上海信裕生物科技有限公司）、羊抗Beclin-1（稀释浓度1∶2000，上海信裕生物科技有限公司）及兔抗Bax（稀释浓度1∶1000，上海信裕生物科技有限公司），置于4°C保存箱，使用Fast Blocking Western封闭液（购自翌圣生物科技公司）过夜孵育，而后使用PBST洗膜3次，10min/次。加入羊抗兔二抗（稀释浓度1∶2000，上海信裕生物科技有限公司）置于室温下进行2h孵育，而后采用ECL显色（显色液以过氧化氢与鲁米诺按1∶1比例配制）。条带的光密度值采用ImageJ1.8.0软件半定量进行分析。目的蛋白的表达量=CDK4、Beclin-1及Bax与β-actin灰度值/内参的灰度值。

1.3观察指标

1患者病灶组织CDK4、Beclin-1及Bax的相对表达量;2CDK4、Beclin-1及Bax在不同病理特征EC患者中的表达情况。

1.4统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，不符合正态分布的计量资料如CDK4、Beclin-1及Bax水平采用M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验，计数资料用[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组患者病灶组织CDK4、Beclin-1及Bax的相对表达量的比较

观察组CDK4表达水平高于对照组，观察组Bax及Beclin-1水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。見表1。

2.2CDK4、Beclin-1及Bax在不同病理特征EC患者中的表达情况

低、未分化程度、FIGO分期III～IV期、有淋巴结转移、肌层浸润≥1/2患者的CDK4表达水平高于中、高分化程度、FIGO分期I～II期、无淋巴结转移、肌层浸润<1/2的患者;低、未分化程度、FIGO分期III～IV期、有淋巴结转移、肌层浸润≥1/2患者中Beclin-1及Bax表达水平低于中、高分化程度、FIGO分期I～II期、无淋巴结转移、肌层浸润<1/2的患者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3讨论

EC是常见女性生殖系统恶性肿瘤，其病死率较高，对女性生命健康构成严重威胁。目前仍尚未完全阐明EC的发病机制，由于EC的发生发展及转归涉及多种复杂因素，在探讨预测EC患者预后指标方面一直以来都是研究热点。相关研究[3-5]显示，子宫内膜癌发病率呈逐年增加的趋势，其主要治疗方法为手术治疗，结合化疗、放疗、免疫疗法等可改善患者预后。相关研究[6]证实，子宫内膜由于血运丰富，可为肿瘤细胞的生长提供大量营养物质。相关研究[7]显示，子宫内膜癌患者癌细胞增殖状态对疾病发展产生重要作用，而病灶部位新生血管是细胞增殖状态的基础且受多种因子的调控，其中CDK4是调控子宫内膜癌患者病灶部位新生血管的主要基因之一。

相关研究[8]显示，CDK4能够结合cyclinD1进而形成促进癌细胞周期改变的复合物，同时体外研究[9]显示，这种复合物对于子宫内膜癌细胞增殖具有诱导作用。机体也能够对癌细胞增殖产生调控作用，主要通过诱导细胞凋亡进而减少受损及衰老细胞，抑制增生性疾病的发生，国外研究[10]显示，在调控细胞凋亡的蛋白中，Beclin-1蛋白家族是参与细胞增殖及凋亡平衡的主要调控蛋白，大量的Beclin-1能够发挥抑制细胞凋亡的作用，同时保护细胞存活并抑制其恶性增殖及异常积累。研究[11]表明，在子宫内膜癌患者病灶组织Beclin-1表达量呈低水平。Bax是Beclin-1家族蛋白中的促凋亡基因，研究[12]显示，Bax在机体组织器官中广泛表达，在细胞发生凋亡且受到死亡信号的刺激后，Bax可从细胞质中转移至线粒体，与线粒体膜结合形成同源二聚体并促进细胞凋亡。此外有研究[13]指出，Bax与线粒体膜结合后能够促进线粒体中细胞色素C进入细胞质，诱导并激活Caspase家族介导的凋亡级联反应，对细胞凋亡产生加速作用。研究[14]表明，自噬作用在多个层面影响肿瘤发展，而Beclin-1是关于机体自噬的抑癌基因，其表达水平升高能够促进癌细胞自噬，主要通过Beclin-1对细胞自噬体成熟的调控作用实现[15]，此外Beclin-1能够与III型磷脂酰基肌醇3激酶结合形成复合物进而调控细胞自噬过程。有研究[9]采用雌激素样受体拮抗剂干预人子宫内膜癌细胞，结果显示，雌激素样受体拮抗剂可通过上调CDK4蛋白表达发挥较弱的促增殖作用。高金利等[16]研究显示，microRNA-203-5p能够通过靶向下调子宫内膜癌小鼠的H编码人表皮生长因子受体4的癌基因，上调Bax的表达水平，进而发挥诱导子宫内膜癌凋亡的作用。在本研究中，观察组的CDK4表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），Beclin-1及Bax的表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），提示在EC患者中存在细胞的增殖速度加快及凋亡速度减慢，与目前文献报道一致[17-19]。分析后认为，细胞自噬及凋亡功能的损害可导致机体无法及时清除正常细胞，进而导致肿瘤细胞的增殖，故在本研究中可观察到EC患者Bax及Beclin-1水平的降低。本研究中对不同病理特征EC患者的CDK4、Beclin-1及Bax表达情况进行分析，结果显示，CDK4在中、高分化、FIGO分期III～IV期、有淋巴结转移、肌层浸润≥1/2患者中表达水平较高，Beclin-1及Bax在中、高分化、FIGO分期III～IV期、有淋巴结转移、肌层浸润≥1/2患者中表达水平较低，差异有统计学意义（P<0.05）。提示Beclin-1及Bax低表达、CDK4高表达的EC患者病灶组织恶性程度更高、侵袭性更强、预后更差。分析后认为，肿瘤临床分期、病理分型及是否合并淋巴转移是评估肿瘤生长情况的重要指标，对于FIGO分期更高、合并淋巴结转移的患者而言，其肿瘤数量更多，疾病严重程度更重，可能是由于Beclin-1及Bax表达下调导致肿瘤细胞过度增殖所致。

综上所述，EC患者病灶组织的Beclin-1、Bax及CDK4与子宫肌瘤患者存在明显差异，Beclin-1、Bax及CDK4可作为评估EC患者预后的指标。

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（收稿日期：2021-09-30）