纯钛表面微纳米形貌对MC3T3-E1细胞的调控作用及机制研究

吴运 吴群 石梦琪

[摘要]目的：研究纯钛表面微纳米形貌对成骨前体细胞MC3T3-E1黏附、迁移及成骨分化的调控作用及机制。方法：纯钛表面抛光作为对照、接种MC3T3-E1细胞作为对照组;采用酸蚀+20 V电压阳极氧化的方法在纯钛表面制备微纳米形貌、接种MC3T3-E1细胞作为微纳米形貌组，转染陰性对照（NC）-siRNA或整合素α2-siRNA作为微纳米形貌+si-NC组、微纳米形貌+si-整合素α2组，给予二甲基亚砜（DMSO）或细胞外调节蛋白激酶（ERK）抑制剂PD98058作为微纳米形貌+DMSO组、微纳米形貌+PD98059组，检测黏附数目、迁移率、成骨诱导分化后OD540及整合素α2、p-ERK、Runx2的表达水平。结果：电镜下观察，酸蚀+20 V电压阳极氧化制备得到管径100 nm的微纳米形貌。微纳米形貌组的黏附数目、迁移率、OD540及整合素α2、p-ERK、Runx2的表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。微纳米形貌+si-整合素α2组的黏附数目、迁移率、OD540及整合素α2、p-ERK、Runx2的表达水平均低于微纳米形貌+si-NC组，差异有统计学意义（P<0.05）。微纳米形貌+PD98059组的黏附数目、迁移率、OD540及p-ERK、Runx2的表达水平均低于微纳米形貌+DMSO组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：纯钛表面微纳米形貌显著促进MC3T3-E1细胞黏附、迁移及成骨分化，这一促进作用与激活整合素α2/ERK/Runx2通路有关。

[关键词]微纳米形貌;纯钛表面改性;整合素α2;黏附;迁移;成骨分化;信号通路

[中图分类号]R783.1    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）06-0078-06

Regulatory Effect and Mechanism of Titanium Surface Micro-nano Topography on Adhesion， Migration and Osteogenic Differentiation of MC3T3-E1 Cells

WU Yun，WU Qun，SHI Mengqi

（Department of Stomatology，Naval Medical Center of PLA，Shanghai 200050，China）

Abstract： Objective  To investigate the effect and mechanism of titanium surface micro-nano topography on the adhesion， migration and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells. Methods The pure titanium surface was polished for control， and MC3T3-E1 cells were inoculated as the control group. The micro-nano topography on the pure titanium surface was prepared by acid etching+20 V voltage anodization method， and MC3T3-E1 cells were inoculated as the micro-nano topography group. The negative control （NC）-siRNA or integrin α2-siRNA was transfected as the micro-nano topography+si-NC group， micro-nano topography +si-integrin α2 group. And DMSO or PD98058 was given as micro-nano topography+DMSO group， micro-nano topography+PD98059 group. The adhesion number， migration rate， OD540 after osteogenic differentiation and the expression level of integrin α2， p-ERK， Runx2 were detected. Results  Under the electron microscope， the micro-nano topography with diameter of 100 nm was prepared by acid etching+20 V anodizing. The adhesion number， migration rate， OD540 and the expression levels of integrin α2， p-ERK and Runx2 in the micro-nano topography group were higher than those in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The adhesion number， migration rate， OD540 and the expression levels of integrin α2， p-ERK and Runx2 in the micro-nano topography+si-integrin α2 group were lower than those in the micro-nano topography+si-NC group （P<0.05）. The adhesion number， migration rate， OD540 and the expression levels of p-ERK and Runx2 in the micro-nano topography+PD98059 group were lower than those in the micro-nano topography+DMSO group（P<0.05）. Conclusion  The titanium surface micro-nano topography significantly promote the adhesion， migration and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells， which is related to the activation of integrin α2/ERK/Runx2 pathway.

Key words： micro-nano topography; surface modification of pure titanium; integrin α2; adhesion; migration; osteogenic differentiation; signal pathway

钛是临床上广泛使用的口腔种植材料，具有良好的生物相容性、抗腐蚀性和机械性能，但因为钛是一种惰性金属，缺乏生物活性，光滑的纯钛表面不利于成骨细胞黏附、铺展及分化，进行种植后存在骨结合不良或不稳定、骨结合时间较长等不足[1-2]。为了在口腔种植治疗后实现更好更快的种植体周围骨结合，近些年越来越多的学者主张对钛表面进行改性，具体是指通过物理、化学、生物等处理形成微纳米形貌以模拟类似细胞外基质的微环境，有利于成骨细胞的黏附、迁移及分化[3-4]。酸蚀、阳極氧化、喷砂、碱热是纯钛表面微纳米形貌常用的制备方法，已有研究证实纯钛表面微纳米形貌对间充质干细胞、成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的黏附、迁移及成骨分化具有促进作用[5-7]，但与之相关的分子机制尚不十分清楚。为了更加深入认识纯钛表面微纳米形貌在口腔种植治疗中的价值，本研究将以成骨细胞前体细胞MC3T3-E1为实验对象，深入探究纯钛表面微纳米形貌对MC3T3-E1细胞黏附、迁移及成骨分化的调控作用及机制。

1  材料和方法

1.1 材料：纯钛样品（拉瓦生物公司，杭州），MC3T3-E1细胞（ATCC公司，美国）;整合素α2-siRNA、阴性对照（Negative control，NC）-siRNA（吉玛公司，上海）;细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）抑制剂PD98059（MCE公司，美国）;二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、茜素红（Sigma公司，美国），整合素α2、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、β-actin一抗（Abcam公司，美国），ERK、磷酸化-ERK（p-ERK）一抗（CST公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 纯钛表面微纳米形貌的制备：参照张琰[7]的研究采用酸蚀+电压下阳极氧化的方法进行纯钛表面微纳米形貌的制备。纯钛样品用400-7000目的SiC水砂纸依次抛光，抛光后的纯钛用于对照，紫外照射消毒后备用。另取抛光的纯钛浸于0.5%氢氟酸溶液、酸蚀20 min，而后以纯钛为阳极、石墨棒为阴极、设置电压为20 V进行阳极氧化1 h，最后依次在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗15 min，紫外照射消毒后备用。

1.2.2 细胞培养及分组：MC3T3-E1细胞在含有10%胎牛血清的培养基中贴壁培养，待细胞融合至90%后用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，传代后的细胞接种在培养板内进行培养及分组。对照组在培养孔内放入抛光后的纯钛样品，而后接种MC3T3-E1细胞;微纳米形貌组在培养孔内放入酸蚀+阳极氧化的纯钛样品，而后接种MC3T3-E1细胞;微纳米形貌+si-NC组和微纳米形貌+si-整合素α2组在培养孔内放入酸蚀+阳极氧化的纯钛样品，而后接种MC3T3-E1细胞，按照说明书转染NC-siRNA或整合素α2-siRNA;微纳米形貌+DMSO组和微纳米形貌+PD98059组在培养孔内放入酸蚀+阳极氧化的纯钛样品，而后接种MC3T3-E1细胞，加入PD98059使其终浓度达到10μmol/L或加入等体积（体积分数0.1%）DMSO。

1.2.3 细胞黏附的检测：细胞接种在纯钛表面后进行分组处理，24 h后用4%多聚甲醛固定0.5 h，0.05% Triton X-100透膜10 min，避光孵育Hochest，在荧光显微镜的高倍视野下进行观察，对黏附的细胞进行计数。

1.2.4 细胞迁移的检测：细胞接种在纯钛表面，融合后在无血清培养基中饥饿8 h，在中央做一划痕并在显微镜下观察，计算划痕面积为A0;按照1.2.2的方法分组处理24 h后，在显微镜下观察划痕并计算划痕面积为A24。按照公式[（A0-A24）/A0]×100%计算迁移率。

1.2.5 细胞成骨分化的检测：细胞接种在纯钛表面，融合后更换为成骨诱导培养液（0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C、10%胎牛血清）进行成骨诱导分化，并按照1.2.2的方法分组，每2 d更换1次成骨诱导培养液。成骨诱导分化第21天，4%多聚甲醛固定0.5 h，1%茜素红染色液孵育20 min，显微镜下拍照;弃去茜素红染色液，加入十六烷基吡啶，37℃孵育15 min，在酶标仪上测定540 nm波长处的吸光值OD540。

1.2.6 整合素α2、p-ERK、ERK、Runx2表达的检测：细胞接种在纯钛表面，融合后按照1.2.2的方法分组，24 h后收集细胞并加入裂解液提取细胞内的蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，根据测定结果取含有30 μg蛋白的样本在SDS-PAGE中进行电泳，电泳后电转移至PVDF膜，而后在5%脱脂牛奶中室温封闭硝酸纤维素（NC）膜1 h，在1：2 000稀释的整合素α2、p-ERK、ERK、Runx2一抗或1：5 000稀释的β-actin一抗中4℃孵育过夜;次日，NC膜在1：2 000稀释的二抗中室温孵育1 h，最后在凝胶成像系统中显影，根据蛋白条带的灰度值、以β-actin为内参计算整合素α2、Runx2的表达水平，以ERK为内参、计算p-ERK的表达水平。

1.3 统计学分析：采用SPSS 21.0软件进行统计分析，实验数据均为计量资料、以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，有统计学差异后进一步比较采用SNK-q检验进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 纯钛表面形貌的电镜观察：电镜下观察纯钛表面形貌如图1所示。对照组纯钛表面光滑，隐约可见少量平行的细小抛光痕;微纳米形貌组纯钛表面可见纳米级结构，纳米管径约100 nm。

2.2 纯钛表面微纳米形貌对MC3T3-E1细胞黏附、迁移及成骨分化的影响：采用Transwell检测细胞黏附、划痕实验检测细胞迁移，比较两组间黏附数目、迁移率的差异。微纳米形貌组MC3T3-E1细胞的黏附数目、迁移率均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见图2A～D;成骨诱导分化后，微纳米形貌组可见大量矿化结节，对照组可见少量矿化结节，微纳米形貌组的OD540水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见图2E～F。

注：A.Hochest荧光染色结果;B.细胞黏附数目比较;C.细胞划痕实验结果;D.细胞迁移率比较;E.成骨诱导分化后的茜素红染色结果;F.OD540水平比较。*表示与对照组比较，P<0.05

2.3 纯钛表面微纳米形貌对MC3T3-E1中整合素α2、p-ERK、Runx2表达的影响：微纳米形貌组MC3T3-E1细胞中整合素α2、p-ERK、Runx2的表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

2.4 转染整合素α2-siRNA对纯钛表面微纳米形貌下MC3T3-E1细胞中整合素α2、p-ERK、Runx2表达的影响：微纳米形貌+si-整合素α2组MC3T3-E1细胞中整合素α2、p-ERK、Runx2的表达水平均低于微纳米形貌+si-NC组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

2.5 敲低整合素α2对纯钛表面微纳米形貌促进MC3T3-E1黏附、迁移及成骨分化的影响：微纳米形貌+si-整合素α2组MC3T3-E1细胞的黏附数目、迁移率均低于微纳米形貌+si-NC组，差异有统计学意义（P<0.05），见图5A～D;成骨诱导分化后，微纳米形貌+si-NC组可见大量礦化结节，微纳米形貌+si-整合素α2组可见少量矿化结节，微纳米形貌+si-整合素α2组的OD540水平低于微纳米形貌+si-NC组，差异有统计学意义（P<0.05），见图5E～F。

2.6 ERK抑制剂对纯钛表面微纳米形貌下MC3T3-E1细胞中整合素α2、p-ERK、Runx2表达的影响：微纳米形貌+PD98059组MC3T3-E1细胞中整合素α2的表达水平与微纳米形貌+DMSO组比较差异无统计学意义（P>0.05）;p-ERK、Runx2的表达水平均低于微纳米形貌组+DMSO组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图6。

2.7 ERK抑制剂对纯钛表面微纳米形貌促进MC3T3-E1黏附、迁移及成骨分化的影响：微纳米形貌+PD98059组MC3T3-E1细胞的黏附数目、迁移率均低于微纳米形貌+DMSO组，差异有统计学意义（P<0.05），见图7A～D;成骨诱导分化后，微纳米形貌+DMSO组可见大量矿化结节，微纳米形貌+PD98059组可见少量矿化结节，微纳米形貌+PD98059组的OD540水平低于微纳米形貌+si-NC组，差异有统计学意义（P<0.05），见图7E～F。

3  讨论

酸蚀、阳极氧化、喷砂、碱热等是常用的纯钛表面改性手段，改性后显著促进成骨前体细胞MC3T3-E1的黏附、迁移及成骨分化具有促进作用[5-6，8-9]。阳极氧化法最早由Gong在2001年报道[10]，与传统的喷砂、酸蚀等方法比较，该方法制备得到的纳米管结构可以更好地改善种植体表面的骨结合[11-12]。国内张琰[7]的实验研究采用酸蚀+阳极氧化的方法进行纯钛表面微纳米形貌的制备，5 V、10 V、20 V电压的阳极氧化分别制备得到管径30 nm、50 nm、100 nm的微纳米形貌，随着电压升高、纳米管径增强，间充质干细胞在纯钛表面的成骨分化能力增强。本研究采用与张琰相同的方法制备得到管径100 nm的纯钛表面微纳米形貌，接种成骨前体细胞MC3T3-E1后发现细胞的黏附、迁移及成骨分化均得到增强，与张琰[7]的实验结果吻合。在此基础上，本研究将对相关的分子机制进行深入探究。

有研究报道，喷砂、酸蚀、等离子喷涂进行纯钛表面改性后，细胞中整合素α5β1、整合素α2等表达增加[13-14]。骨质疏松相关的研究证实整合素α2对间充质干细胞、成骨前体细胞的黏附、迁移及成骨分化具有促进作用[15-17]。本研究在纯钛表面制备微纳米形貌后接种MC3T3-E1细胞，细胞中整合素α2的表达水平明显增加;通过转染siRNA的方式敲低整合素α2的表达后，微纳米形貌促进MC3T3-E1细胞黏附、迁移及成骨分化的作用明显减弱，表明酸蚀+阳极氧化制备的微纳米形貌通过上调整合素α2表达的途径促进成骨前体细胞的黏附、迁移及成骨分化。

MAPK家族是整合素发挥生物学作用的细胞内信号转导通路[18]。蒋代富[17]在间充质干细胞中证实整合素α2通过激活MAPK家族中的ERK调控细胞迁移及黏附、成骨分化的调控。本研究发现纯钛表面微纳米形貌增加MC3T3-E1细胞中p-ERK、Runx2的表达，敲低整合素α2后细胞中p-ERK、Runx2的表达降低，表明纯钛表面微纳米形貌通过上调整合素α2表达的途径促进下游ERK激活、Runx表达。在MC3T3-E1细胞接种在纯钛表面微纳米形貌的同时加用ERK抑制剂处理，结果发现微纳米形貌促进MC3T3-E1细胞黏附、迁移及成骨分化的作用明显减弱。以上敲低整合素α2、抑制ERK的反向验证实验表明整合素α2/ERK/Runx2通路在纯钛表面微纳米形貌促进成骨前体细胞黏附、迁移及成骨分化中起重要作用。

综上所述，本研究采用酸蚀+20 V电压的阳极氧化方法在纯钛表明制备了管径为100 nm的微纳米形貌，该微纳米形貌显著促进成骨前体细胞MC3T3-E1的黏附、迁移及成骨分化，并且本研究还初步阐明了微纳米形貌发挥上述作用的分子机制与促进整合素α2/ERK/Runx2通路激活有关，这是本研究的创新性所在。本研究的上述实验结果为今后发现更优的纯钛表面改性方法、改进纯钛种植体移植治疗的效果提供了新思路。

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[收稿日期]2021-07-14

本文引用格式：吳运，吴群，石梦琪.纯钛表面微纳米形貌对MC3T3-E1细胞的调控作用及机制研究[J].中国美容医学，2022，31（6）：78-83.