益生屎肠球菌RS3的分离鉴定及增殖条件的优化

刘玮，曹威，刘浩，潘梅*

（1.桂林南药股份有限公司，广西 桂林 541004；2.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

随着人们生活水平的提高，人们对于健康的关注和需求也日益多样化。益生菌具有合成分泌多种营养物质，改善肠道微环境、免疫调节、抗过敏、抗感染等多种作用[1]。同时随着对肠道科学研究的不断深入，大众对益生菌剂需求也日益旺盛。筛选品质性状优良的菌种则是益生菌剂开发中重要的一环。

乳酸菌是一类可以利用糖进行发酵代谢生产乳酸的细菌的总称，在自然界中分布广泛，其中绝大部分都是动物体内具有重要生理功能且必不可少的菌群[2-4]。乳酸菌具有促进机体生长、维持肠道菌群生态平衡和改善机体免疫能力等功效，并以其公认的安全性（generally recognized as safe，GRAS）在世界范围内被广泛应用于食品工业、畜牧业等[5]。泡菜是一种中国传统的发酵食品，泡菜中微生物菌群复杂多样，乳酸菌便是其中重要的一类，其产生的多种有机酸和蛋白酶等物质在赋予泡菜特有风味的同时，也使泡菜具有多种保健功效，如促进肠道蠕动、帮助人体消化、降低胆固醇以及调节生理机能等[6]，因此，泡菜成为筛选获得性状优良的乳酸菌的重要来源、开发益生菌剂的良好材料。

屎肠球菌是一种革兰氏阳性、兼性厌氧的乳酸菌，肠球菌属，是动物肠道正常菌种之一，在肠道微生物菌群中占有一定比例，与其它肠道益生菌相互协作共同维持宿主的正常生理功能[7-8]，该菌具有较强的抗逆性，即具有耐酸碱、耐高温、耐高盐、对氧气存在与否无要求、肠道黏附能力好、对部分抗生素也具备很好的耐受性等生长特点[9]，广泛存在于乳制品[10]、泡菜[11]、豆酱[12]以及香肠[13]等传统的发酵食品中，对食品的香气、风味、质地等均有一定的影响，能产生多种有益成分，是工业化生产乳酸菌制品的首选菌种之一[14-15]。

本文以从传统发酵食品泡菜中分离筛选获得的一株屎肠球菌RS3为研究对象，以培养结束后生物量及乳酸含量为主要考核指标，研究培养基中碳源、氮源、氯化钠浓度、pH值及发酵温度等单因素对菌体生长的影响，进而通过响应面法的中心组合设计试验确定培养基成分及其最佳配比和培养温度，实现屎肠球菌RS3的高效增殖培养，为其进一步开发为益生菌剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

泡菜：市售，取回后置于4℃冰箱保存待用。

1.1.2 试剂

蔗糖（分析纯）、糖蜜（生化级）、淀粉（生化级）、牛肉膏（生化级）、琼脂粉（生化级）、尿素（分析纯）、玉米浆（生化级）：北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖、氯化钠、乳糖、硫酸铵（均为分析纯）：生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白胨（生化级）：英国OXOID公司；血平板（成品培养基）：广东环凯微生物科技有限公司；EasyPureBacteria Genomic DNA Kit：北京全式金生物技术有限公司。

1.1.3 培养基制备

含糖牛肉汤液体培养基：牛肉膏10g/L、氯化钠5g/L、胰蛋白胨20 g/L、乳糖20 g/L，121℃灭菌20 min。固体培养基在液体培养基的基础上添加琼脂15 g/L。

1.2 仪器与设备

双人超净工作台（SW-CJ-1FD）：苏净集团苏州安泰空气技术公司；pH计（METTLER TOLEDO）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；紫外分光光度计（UV-1800）：上海美普达仪器有限公司；分析天平（BSA124S）：赛多利斯科学仪器有限公司；电热恒温培养箱（DH-4000B）：天津市泰斯特仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-75KBS）：上海申安医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的分离和纯化

取泡菜汁液25 mL于225 mL无菌生理盐水中稀释，并以10倍梯度稀释方式稀释至10-6，将稀释后菌液均匀涂布于含有1.5%碳酸钙的含糖牛肉汤固体培养基中，于37℃电热恒温培养箱中倒置培养12 h，挑取含有透明圈、长势优良的单菌落重复涂布于培养基中，挑取该单菌落，选取表型稳定的单菌落为后期试验菌株。

1.3.2 菌株鉴定

将挑选出的菌株于含糖牛肉汤液体培养基中37℃培养12 h，收集菌体，利用EasyPureBacteria Genomic DNA Kit提取基因组DNA，以通用引物对27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增该菌株的16 S rRNA序列。PCR反应体系：基因组1 μL，TransStartFastPfu DNA Polymerase 0.5 μL，5×FastPfu Buffer 4 μL，正反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，脱氧核糖核苷三磷酸混合物（eoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）（2.5mmol/L）2μL，加灭菌水至20μL。扩增条件：94℃、10 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35 个循环；最后72℃、10 min。扩增产物由金唯智生物科技有限公司进行双向测序。测序结果利用NCBI网站中的BLATN 比对（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

同时，对获得的菌株进行生化鉴定试验，包括糖发酵试验、溶血试验和透明圈试验[16]。

1.3.3 增殖培养

挑取单菌落，接种于装有40 mL含糖牛肉汤液体培养基的100 mL三角瓶中，于37℃电热恒温培养箱中静置培养12 h。吸取种子培养液，以1%（体积分数）的接种量转接到装有100 mL含糖牛肉汤液体培养基的250 mL三角瓶中，于37℃恒温培养箱中静置培养12 h。

1.3.4 乳酸含量测定

取屎肠球菌RS3培养菌液2 mL于Eppendorf管中，12 000 r/min离心10 min，取上清液，稀释20倍后经0.22 μm滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。色谱柱为AminexHPX-87H 色谱柱（300 mm×7.8 mm）。检测条件：流动相为0.005 mol/L H2SO4溶液、流速0.6 mL/min、柱温为65℃、检测器波长210 nm、进样量20 μL、检测时间 22 min。

1.3.5 培养基优化单因素试验

1.3.5.1 生长pH值优化

控制含糖牛肉汤培养基中其他组分不变，分别将培养基初始pH值调整为4.0、5.0、6.0、7.0、7.2、7.5、8.0、9.0和10.0下对屎肠球菌RS3进行增殖培养，进行单因素试验。

1.3.5.2 培养温度优化

控制含糖牛肉汤培养基中其他组分不变，分别在20、25、30、37、45 ℃的培养条件下培养屎肠球菌RS3，进行单因素试验。

1.3.5.3 乳糖浓度优化

控制含糖牛肉汤培养基中其他组分不变，分别在10、15、20、25、30 g/L乳糖的培养条件下培养屎肠球菌RS3，进行单因素试验。

1.3.5.4 胰蛋白胨浓度优化

控制含糖牛肉汤培养基中其他组分不变，分别在10、15、20、25、30 g/L胰蛋白胨的培养条件下培养屎肠球菌RS3，进行单因素试验。

1.3.6 中心复合响应面设计试验

为了确定培养基中各种组分的最佳配比及屎肠球菌RS3最佳培养条件，选取培养基初始pH值、培养温度、培养基乳糖浓度和胰蛋白胨浓度4个影响较大的因素进行响应面试验设计，因素与水平见表1。

表1 试验因素编码及水平Table 1 The coding and standard of empirical factor

1.3.7 菌体生物量的测定方法

取37℃恒温静置培养12 h后的发酵液100 mL于离心管中进行离心（4℃，10 000 r/min，15 min），收集湿菌体，用蒸馏水洗涤菌体2次后，将获得的湿菌体置于60℃下恒温干燥至恒重，用称量法测定其生物量。

1.4 数据处理

运用Design-Expert 12软件进行响应面设计和方差分析，Origin 8软件进行图片绘制。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化及鉴定

菌株在不同培养基上的菌落特征及对不同碳源的发酵情况见图1。

图1 菌株在不同培养基上的菌落特征及对不同碳源的发酵情况Fig.1 Colony characteristics of strains on different media and fermentation of different carbon sources

由图1A可知，从泡菜中筛选分离得到一株长势优良的乳酸菌株RS3，菌落形态呈圆形，大而光滑具有光泽，颜色呈乳白色，质地均匀，不透明，边缘整齐。于含有碳酸钙培养基上有透明圈产生（图1B），在血平板上生长菌落周围出现溶血圈（图1C），在不同碳源生化管中与阿拉伯糖和甘露醇反应呈阳性、与山梨醇和D-棉子糖反应呈阴性（图1D），革兰氏染色为阳性菌株，16 S rRNA 测序（GenBank：MZ310419）鉴定该菌株属于肠球菌属（Enterococcus sp.）。综合分析并查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》[17]和《常见细菌系统鉴定手册》[18]此菌株为屎肠球菌（Enterococcus faecium）。

2.2 屎肠球菌RS3的生长与乳酸合成的关系

益生菌剂中乳酸菌比重较大，通过在肠道中分泌乳酸使肠道微环境pH值降低，抑制致病菌侵袭繁殖，增强肠道免疫能力[19]。为了研究屎肠球菌RS3菌体生长与乳酸合成的关系，对不同菌体生长阶段的菌悬液中的乳酸浓度进行测定，结果见图2。

图2 屎肠球菌RS3菌体生长与乳酸合成的关系Fig.2 The relationship between E.faecium RS3 growth and lactic acid synthesis

如图2所示，屎肠球菌RS3乳酸的积累与菌株生长相偶联。在含糖牛肉汤液体培养基中培养时，0～2 h为延迟期，菌株生长缓慢，乳酸开始积累但水平较低；2 h～8 h为对数期，菌株生长代谢均旺盛，乳酸快速积累，8 h乳酸产量为5.66 g/L；8 h～12 h为稳定期，随着菌体培养时间的延长，乳酸产量保持稳定。

2.3 pH值对屎肠球菌RS3生物量的影响

在以含糖牛肉汤液体培养基为基础培养基，调整不同的初始 pH 值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、7.2、7.5、8.0、9.0以及10.0，37℃静置培养12 h结束后离心收集菌体，采用恒温称重法测定其生物量。不同pH值对菌体生长的影响见图3。

图3 不同pH值对菌体生长的影响Fig.3 Effects of different pH on bacterial growth

如图3所示，不同培养基初始pH值对菌株增殖生长影响较大，当培养基pH值为7.0～9.0时，菌体生物量较大，在pH值为8.0时，菌体生物量达到最大值58.1mg/100 mL，而培养基pH值小于6.0或大于9.0时，屎肠球菌RS3的生长受到显著抑制。

2.4 培养温度对屎肠球菌RS3生物量的影响

以含糖牛肉汤液体培养基为基础培养基，接种后分别置于20、25、30、37、40 ℃下静置增殖培养 12 h，离心收集菌体，采用恒温称重法测定其生物量。不同培养温度对菌体生长的影响见图4。

图4 不同培养温度对菌体生长的影响Fig.4 Effects of different culture temperature on bacterial growth

如图4所示，在20℃～37℃增殖培养时，随着培养温度的升高，屎肠球菌RS3生物量也随之增高，而当培养温度超过37℃时，菌体生物量迅速下降，因此，屎肠球菌RS3生长的最佳培养温度为37℃，此时生物量可达61.2 mg/100 mL。

2.5 乳糖浓度对屎肠球菌RS3生物量的影响

以含糖牛肉汤液体培养基为基础培养基，调整乳糖的终浓度分别为10、15、20、25、30 g/L进行屎肠球菌的增殖培养，37℃静置培养12 h后离心收集菌体，采用恒温干燥称重法测得其生物量。不同乳糖浓度对菌体生长的影响见图5。

图5 不同乳糖浓度对菌体生长的影响Fig.5 Effects of different concentration of lactose on bacterial growth

如图5所示，乳糖浓度在10 g/L～30 g/L范围内对屎肠球菌进行增殖培养时，在15 g/L～20 g/L时，生物量达到最大为61.66 mg/100 mL，当浓度超过20 g/L时，生物量随着浓度增加呈现下降趋势。

2.6 胰蛋白胨浓度对屎肠球菌RS3生物量的影响

以含糖牛肉汤液体培养基为基础培养基，调整胰蛋白胨的终浓度分别为10、15、20、25、30 g/L进行屎肠球菌的增殖培养，37℃静置培养12 h后离心收集菌体，采用恒温干燥称重法测得其生物量。不同乳糖浓度对菌体生长的影响见图6。

图6 不同胰蛋白胨浓度对菌体生长的影响Fig.6 Effects of different concentration of tryptone on bacterial growth

如图6所示，胰蛋白胨浓度在10 g/L～25 g/L范围内对屎肠球菌进行增殖培养时，随着胰蛋白胨浓度的升高，屎肠球菌RS3生物量也随之增高，而当胰蛋白胨浓度超过25 g/L时，菌体生物量基本维持不变。因此，屎肠球菌RS3生长的最佳胰蛋白胨浓度为25 g/L，此时生物量可达61.15 mg/100 mL。

2.7 响应面结果分析

在单因素试验的基础上，以菌体密度（OD600）为响应值（Y），采用统计分析软件Design-Expert 12进行试验设计、数据处理及模型的建立，试验设计与结果见表2。

表2 中心组合试验设计及试验结果Table 2 Experimental design and experimental result of central combination

续表2 中心组合试验设计及试验结果Continue table 2 Experimental design and experimental result of central combination

根据试验结果，对所得数据进行回归分析，得到关于编码值的回归方程，方程如下：Y=2.52+0.025A-0.13B-0.079C+0.28D+0.063AB-0.048AC+0.021AD-0.018BC-0.009 25BD+0.001 25CD-0.23A2-0.14B2-0.012C2-0.043D2。

方差分析见表3。

由表3可知，模型极显著（P＜0.01），表明模型相关度好，即所选4个因素（pH值、培养温度、乳糖浓度及胰蛋白胨浓度）之间相互效应显著；其次该模型的失拟项不显著（P＞0.05），表明该模型精确度高，实测值与预测值之间无失拟存在。模型相关系数R2=0.988 1，调整决定系数R2Adj=0.977 0，表明此模型可以解释97.7%响应值变化。表明该模型具有较好的拟合度，预测性较准确。因素 B、C、D，交互项 AB、AC 及二次项 A2、B2和D2对菌体密度的影响均呈极显著水平（P＜0.01）。根据F值可知，各因素对菌体密度影响的大小为胰蛋白胨浓度＞培养温度＞乳糖浓度＞pH值。

表3 方差分析Table 3 Analysis of varianc

交互作用响应面图及等高线图见图7。

图7 响应面三维图和等高线图Fig.7 Three dimensional graphic and contour response surface diagrams

由图7a可以看出，当增殖培养温度不变时，随着培养基pH值的增加，菌体密度呈现先上升后下降的趋势，当培养基pH值保持不变时，随着培养温度的升高，菌体密度也是呈现先上升后下降的趋势；由图7b可以看出，其交互项的作用趋势与图7a相似，在各因素中心点菌体密度最高，回归方程具有最优水平。根据拟合方程可以得到各个编码所对应真实值近似为pH 8.2、培养温度37℃、乳糖15 g/L、胰蛋白胨25 g/L。经优化后屎肠球菌RS3发酵12 h其菌体浓度OD600的理论值可以达到2.834。

优化前后培养基对菌体生长的影响见图8。

图8 优化前后培养基对菌体生长的影响Fig.8 Effects of optimized medium on bacterial growth

由图8可知，屎肠球菌RS3在未优化培养条件下培养其最终生物量为63.7 mg/100 mL，在优化后的培养条件下最终生物量达到98.7 mg/100 mL，与优化前相比提高了54.9%，同时培养液中乳酸含量提高了53%，达到8.81 g/L。对两种培养基中菌体进行革兰氏染色，优化后培养基中菌体生物量明显高于优化前培养条件下的菌体量（图9）。

图9 屎肠球菌RS3革兰氏染色观察（1 000×）Fig.9 Gram staining of Enterococcus faecium RS3（1 000×）

3 结论

从市售泡菜汁液中分离鉴定得到一株乳酸菌，经生化和分子生物学实验鉴定为屎肠球菌RS3。本文在单因素的基础上，采用四因素五水平的响应面分析法对屎肠球菌RS3的最适培养条件进行了研究，得到最佳培养条件为乳糖15 g/L、胰蛋白胨25 g/L、牛肉膏10 g/L、氯化钠5 g/L，培养基初始pH值为8.2，菌株培养温度为37℃。根据优化后培养条件进行屎肠球菌RS3的增殖培养，其最终生物量相比于优化前提高了54.9%，达到了98.7mg/100mL，且其乳酸含量由5.76g/L提高到8.81 g/L。综上，本研究筛选到一株乳酸菌屎肠球菌RS3，对其培养条件进行响应面优化，建立了菌体高效增殖培养条件，为其进一步工业化发酵生产开发为益生菌剂提供参考。