广玉兰内酯抗脓毒症潜在靶点的筛选与鉴定

庄雅茜　　陈赛贞　　徐煜彬　　陈桂荣

[摘要] 目的 研究广玉兰内酯的分子特性，对其抗脓毒症的潜在靶点进行筛选并鉴定。方法  通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）数据库分析广玉兰内酯的药理参数和分子特性;广玉兰内酯抗脓毒症靶点的确定，通过DRAR-CPI和Swiss Targetprediction软件筛选广玉兰内酯的潜在靶点，将OMIM、CTD以及TTD数据库中已被报道与脓毒症相关的疾病靶标进行匹配确定;通过分子对接软件鉴定广玉兰内酯抗脓毒症的潜在靶点，然后对潜在靶点进行作用通路分析。结果  广玉兰内酯成药性良好，其口服生物利用率为63.71%，药物相似度为0.19;在DRAR-CPI和Swiss Targetprediction软件中共筛选到150个潜在靶点，有9个与脓毒症相关的靶点，通过分子对接软件鉴定ELANE、S100A9、G6PD、ACE2、PTGS2和CASP3为广玉兰内酯抗脓毒症的潛在靶点，肿瘤坏死因子信号通路和5-羟色胺能突触为其作用通路。结论  广玉兰内酯可能通过ELANE、S100A9、G6PD、ACE2、PTGS2以及CASP3调控肿瘤坏死因子信号通路和5-羟色胺能突触起到缓解脓毒症的炎症作用，同时对脓毒症损伤的器官起到保护作用。

[关键词] 广玉兰内酯;靶点;脓毒症;分子对接

[中图分类号] R96;R631          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2022）17-0143-04

Screening and identification of potential anti-sepsis targets of magnograndiolide

ZHUANG Yaxi1   CHEN Saizhen1   XU Yubin1   CHEN Guirong2

1. Department of Pharmacy， Taizhou University Hospital， Taizhou Central Hospital in Zhejiang Province， Taizhou 318000， China; 2.School of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 116600， China

[Abstract] Objective To study the molecular characteristics of magnograndiolide， screen and identify its potential anti-sepsis targets. Methods The pharmacological parameters and molecular characteristics of magnograndiolide were analyzed by the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP）. In terms of determining the anti-sepsis targets of magnograndiolide， the potential targets of magnograndiolide were screened by DRAR-CPI and SwissTargetprediction software， and the disease targets reported to be related to sepsis in OMIM， CTD and TTD databases were matched and determined. The potential anti-sepsis targets of magnograndiolide were identified by molecular docking software， and then the action pathway of the potential targets was analyzed. Results Magnograndiolide had good developability with the oral bioavailability of 63.71% and the drug similarity of 0.19. A total of 150 potential targets were screened by DRAR-CPI and Swiss Targetprediction software， and 9 targets were related to sepsis. ELANE， S100A9， G6PD， ACE2， PTGS2 and CASP3 were identified as the potential anti-sepsis targets of magnograndiolide by molecular docking software. Tumor necrosis factor signaling pathway and serotonin synapse were the action pathways. Conclusion Magnograndiolide may regulate tumor necrosis factor signaling pathway and serotonin synapse through ELANE， S100A9， G6PD， ACE2， PTGS2 and CASP3， which can alleviate the inflammation of sepsis and protect the organs from injury caused by sepsis.

[Key words] Magnograndiolide; Target; Sepsis; Molecular docking

脓毒症主要死亡原因是由感染引起的，是由宿主对感染的失调反应引发的危及生命的器官功能障碍征[1]。自20世纪90年代以来，对脓毒症的知识经历了三种不同的定义[2，3]。然而，一般来说，“脓毒症”是由致病因素与宿主全身反应形成的综合征，若存在器官衰竭或低血压，则进一步归类为“严重脓毒症”或“脓毒性休克”。许多研究表明脓毒症发病率和病死率逐渐上升，近10年年发病率为437/10万，病死率为17%[4，5]。全球范围内严重脓毒症类似年增加[6]。尽管脓毒症的发病率不断提高，但在目前的临床实践指南中对脓毒症无明确有效的药物。因而探寻防治脓毒症有效的药物与方法有重要的应用前景和临床意义。

前期通过网络藥理学发现黄连解毒汤抗脓毒症的有效成分之一为广玉兰内酯。见图1。但目前对广玉兰内酯药理作用的研究较少，其抗脓毒症的靶点和机制尚未被研究。因而本文对广玉兰内酯抗脓毒症的潜在靶点进行筛选与分析[7，8]。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

广玉兰内酯（PubChem CID：5319198）sdf格式文件，中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），药物再定位及药物不良反应预测（Drug Repositioning and Adverse Drug Reaction Chemical-Protein Interactome，DRAR-CPI）（https：//cpi.bio-x.cn/drar），SwissTargetprediction服务器（http：//www.swisstargetprediction.ch），分子对接服务器（http：//systemsdock.unit.oist.jp）。

1.2 方法

1.2.1 药理参数、分子特性评价与靶标预测  通过TCMSP数据库来评价广玉兰内酯的药代动力学参数与分子特性。采用DRAR-CPI和Swiss Targetprediction来筛选广玉兰内酯药物靶点。通过在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、毒性与基因比较数据库（The Comparative Toxicogenomics Database，CTD）、药物靶点数据库（Therapeutic Targets Database，TTD）（网址分别为http：//www.omim.org/、https：//ctdbase.org/、http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）筛选脓毒症疾病靶点。匹配以上筛选到的靶点，得到广玉兰内酯抗脓毒症靶点。

1.2.2 分子对接  将1.2.1涉及到的相关蛋白PDB ID输入到分子对接服务器，再上传广玉兰内酯的sdf文件，点击开始对接并对进行结果分析。

1.2.3 广玉兰内酯抗脓毒症作用通路研究  将1.2.2涉及到的相关蛋白进行KEGG通路分析。

2 结果

2.1 药理参数及分子特性评价

广玉兰内酯口服生物利用度为63.71%>30.00%，药物相似度为0.19>0.18，可旋转键数为0<10，表明具有较好的成药性[8]。药物半衰期较短为3.17，短时疗效较强，可考虑制成缓释或控释制剂。广玉兰内酯的相对分子质量为266.37 Da，油水分配系数为1.18，氢键供体为2、受体为4，与Lipinski[9]的5原则较为一致。

2.2 靶标预测

在Swiss Targetprediction服务器中筛选出15个广玉兰内酯的相关靶点;在DRAR-CPI筛选z'<-0.5的靶标135个;合并以上两个服务器筛选到的靶点，将重复的靶点删除共得到150个靶点。

在OMIM、CTD和TTD三个数据库中输入“sepsis”，共筛选得到149个脓毒症靶点，与上述150个药物靶点进行匹配，发现9个广玉兰内酯抗脓毒症靶点，分别为ELANE、S100A9、G6PD、PTGS2、IL10、LCN2、CASP1、ACE2和CASP3，具体筛选流程见图2。

2.3 分子对接

分子对接结果显示广玉兰内酯与LCN2对接过程中抑制常数（Est.Inhibition Constant，Ki）=1.48 μmol/L，自由结合能为-3.86 kcal/mol;与S100A9对接过程中Ki=84.02 μmol/L，自由结合能为-5.56 kcal/mol;与ACE2对接过程中Ki=158.98 μmol/L，自由结合能为-5.18 kcal/mol;与ELANE对接过程中Ki=79.76 μmol/L，自由结合能为-5.59 kcal/mol;与CASP3对接过程中Ki=72.36 μmol/L，自由结合能为-5.65 kcal/mol;与G6PD对接过程中Ki=36.98 μmol/L，自由结合能为-6.05 kcal/mol;与IL10对接过程中Ki=246.00 μmol/L，自由结合能为-4.92 kcal/mol;与CASP1对接过程中自由结合能为0.60 kcal/mol;与PTGS2对接过程中Ki=995.25 nmol/L，自由结合能为 -8.19 kcal/mol，以上计算结果的自由结合能小于-5 kcal/mol的靶标有CASP3、ELANE、S100A9、ACE2、G6PD和PTGS2，表明广玉兰内酯有结合这些靶标的能力[10]。

从封三图3可看出广玉兰内酯与G6PD的疏水相互作用残基包括TYR147，PRO144，LEU43和GLU170;广玉兰内酯与PTGS2疏水相互作用残基包括LEU534、PHE381、LEU352、ALA527、LEU384、LEU531、 PHE518、MET522、TYP385、TRP387、VAL349和VAL523，表明广玉兰内酯可能通过这些关键残基与PTGS2以及G6PD产生交互作用来起到相应的药效。

2.4 广玉兰内酯抗脓毒症作用通路研究

将2.3项下涉及广玉兰内酯抗脓毒症的靶点CASP3、ELANE、S100A9、ACE2、G6PD和PTGS2导入DAVID 6.8软件进行通路分析，发现其主要参与肿瘤坏死因子信号通路和5-羟色胺能突触两条信号通路。

3 讨论

脓毒症尤其是严重脓毒症仍是导致重症监护病房患者非心脏死亡的主要因素，也是医疗的一个巨大负担，目前没有特别有效的治疗措施和药物，寻找有效的抗脓毒症药物也是急需任务之一。本研究发现广玉兰内酯可能通过结合CASP3、ELANE、S100A9、ACE2、G6PD和PTGS2等蛋白起到抗脓毒症作用。本研究结果为探讨广玉兰内酯抗脓毒症筛选出了潜在的研究靶点，但其抗脓毒症的具体机制与进一步的实验验证，有待深入探索与研究。

S100A9是一种钙锌结合蛋白，能通过增强吞噬细胞活化和白细胞募集从而放大炎症反应，在调节炎症过程和免疫反应中起着重要作用，研究表明S100A9能诱导晚期脓毒症小鼠髓样衍生抑制细胞的扩增[11]。S100A9也是异二聚体损伤相关分子模式S100A8/A9的组成部分，S100A8/A9作为Toll样受体4的内源性配体在天然免疫反应中起到重要的作用，在对脓毒症的应答中能放大TNF-α产生的效应，在接受盲肠结扎穿刺法并存活两周的脓毒症小鼠小胶质细胞中发现其表达上調[12]。另有研究证实S100A8/A9是脓毒症后持续神经炎症的重要介质[13]。PTGS2是使花生四烯酸转化成前列腺素的关键酶，在脓毒症中发挥着重要作用，它能通过改变促炎和抗炎细胞因子之间的动态平衡，同时作用机体的特异性和非特异性免疫系统来调节肠屏障功能以及肝脏损伤，机体红肿，热痛等状况[14]。有研究也表明PTGS2在脓毒症中高表达，且肠黏膜屏障功能障碍是脓毒症病理生理进展中重要的机制之一[15]。S100A9蛋白参与的肿瘤坏死因子信号通路能够调节各种细胞和生物事件与脓毒症密切相关[16]。5-羟色胺能突触在炎症的发生发展过程中，起调节免疫应答，促炎症因子释放，促氧化应激反应，影响微循环等作用[17]。广玉兰内酯可能通过结合S100A9和PTGS2减少TNF-α和5-羟色胺的释放从而减少脓毒症导致的炎症起抗脓毒症作用。此外，广玉兰内酯可能通过减少ELANE和增加G6PD的表达起抗脓毒症作用，研究表明ELANE在脓毒症大鼠中表达上调，G6PD缺乏是脓毒症的危险因素[18，19]。

脓毒症病情发展过程中，心功能不全是脓毒症相关多器官功能衰竭的重要组成部分。在调控心肌功能障碍中CASP3起重要作用，激活的CASP3可诱导心肌细胞凋亡[20]。阻断心肌CASP3激活能显著改善心肌功能障碍，提高脓毒症患者的存活率[21]。严重脓毒症引起的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratry distress syndrme，ARDS）仍然是重症监护医学的主要挑战，ACE2已被证明对肺损伤有保护作用，AEC2能抑制ERK/NF-κB激活，通过Ang-（1-7）/Mas途径抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的ARDS[22]。因此，广玉兰内酯可能是通过结合CASP3和ACE2对脓毒症患者的心肌损伤和肺损伤起到保护作用。

广玉兰内酯可能通过S100A9、ELANE、G6PD、PTGS2、ACE2以及CASP3调控肿瘤坏死因子信号通路和5-羟色胺能突触起到缓解脓毒症的炎症作用，同时对脓毒症损伤的器官起到保护作用。

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（收稿日期：2021-06-30）