褪黑素调控SIRT3对糖尿病脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织线粒体的保护作用

李亚男，刘恋，李冰玉，夏中元，赵博

武汉大学人民医院麻醉科，武汉 430060

脑灌注恢复所诱发的脑缺血再灌注损伤（CIRI）一直是临床治疗中的难点[1]。糖尿病是CIRI预后不良的独立危险因素之一[2]。新近研究证实，去乙酰化酶3（SIRT3）主要在线粒体表达，是调控细胞氧化应激、对抗损伤的关键[3]。SIRT3表达降低可导致肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝和神经退行性疾病的发生[4]。研究表明，CIRI初期线粒体内活性氧（ROS）大量产生，进而引起脂质过氧化等一系列损伤反应，而保护线粒体结构和功能可显著减轻损伤[5]。因此，通过调控SIRT3保护线粒体以减轻神经元损伤已成为目前研究的焦点[6]。褪黑素主要在大脑中表达，发挥重要的神经保护作用。还有研究者在胰岛细胞内发现了褪黑素受体，提示褪黑素对糖脂代谢亦具有调控作用[7]，但具体机制尚未完全阐明。2020年1月—2021年12月，本研究观察了褪黑素对糖尿病CIRI小鼠脑组织线粒体的保护作用，并基于SIRT3表达调控探讨褪黑素的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要材料 清洁级健康雄性C57BL/6小鼠24只，6～8周龄，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养条件：湿度65% ±5%、温度（25±1）℃，光照周期（12 h光照/12 h黑暗）。链脲佐菌素（STZ）购自Sigma公司，褪黑素购自Sigma-Aldrich公司，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒及线粒体提取试剂盒购自南京建成公司，核呼吸因子1（NRF1）、线粒体转录因子A（TFAM）抗体购自Abcam公司，胞质细胞色素C（Cyt-Cyto C）、3-TYP、β-actin、HRP标记的二抗购自CST公司。血糖仪购自强生公司，MCAO线栓购自Doccol公司，低温高速离心机购自Thermo公司，电泳仪购自Bio-Rad公司，手术显微镜（凤凰COX6100），Olympus倒置显微镜，Hitachi透射电镜。

1.2 动物分组、造模及给药方法 将24只小鼠随机分为糖尿病假手术组（DS组）、糖尿病缺血再灌注组（DIR组）、糖尿病缺血再灌注+褪黑素组（DIR+Mel组）、糖尿病缺血再灌注+褪黑素+3-TYP组（DIR+Mel+3-TYP组）。4组小鼠均制作糖尿病模型：小鼠适应性喂养1周，造模前禁食12 h，尾静脉采血记录空腹血糖，连续5 d腹腔注射1%的STZ 50 mg/kg，1周后尾静脉测随机血糖，当血糖值≥16.7 mmol/L并出现多饮、多食、多尿、体质量减轻症状，表明1型糖尿病模型制作成功。DIR组、DIR+Mel组、DIR+Mel+3-TYP组采用tMCAO法建立脑缺血再灌注模型：深度麻醉小鼠，消毒后颈部正中切口，显微镜下暴露左颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉；在颈总动脉上剪一小口，将头端为硅树脂涂层的6-0线栓由颈总动脉插入到颈内动脉，遇到阻力后停止；缺血1 h后将线栓小心取出进行再灌注，逐层缝合伤口；DS组分离大脑中动脉但不阻断血流；小鼠苏醒后，观察到小鼠出现以右前肢为重的偏瘫时则认为模型构建成功。DIR+Mel组、DIR+Mel+3-TYP组于缺血即刻和再灌注前腹腔注射褪黑素10 mg/kg。DIR+Mel+3-TYP组于tMCAO术前5、3、1 d分别腹腔注射SIRT3特异性抑制剂3-TYP 50 mg/kg。再灌注24 h后处死各组小鼠。

1.3 病灶脑组织线粒体超微结构观察 取1 mm3缺血半暗带组织，用2.5%戊二醛固定24 h，磷酸缓冲液冲洗后再使用1%锇酸-0.1 mol/L磷酸缓冲液固定2 h，梯度乙醇脱水，丙酮包埋渗透过夜，聚合48 h后制备超薄切片。铀—铅双染干燥过夜，次日电镜下观察线粒体超微结构。

1.4 病灶脑组织线粒体氧化应激水平及ATP含量检测 取缺血半暗带脑组织，应用线粒体提取试剂盒分离胞质与线粒体，-80℃保存备用。按说明书操作测定MDA含量、SOD活性、CAT活性。将备用的线粒体依次加入底物液、促进剂和双蒸水，混匀后37℃水浴并加入沉淀剂离心取上清，加入显色剂静置5 min后终止反应。在636 nm下测定吸光度，计算ATP含量。

1.5 病灶脑组织线粒体生成因子NRF1、TFAM、Cyt-Cyto C检测 取适量缺血半暗带组织，加入裂解液后制备匀浆液，测定蛋白浓度。配置SDS-PAGE凝胶，加载样品后在80 V下电泳。当溴酚蓝指示剂到达浓缩胶与分离胶连接处，改用120 V恒定电压分离后并转膜。TBST封闭，加入NRF1、TFAM、Cyt-Cyto C（1∶1 000）一抗，4℃孵育过夜。次日加入相应二抗孵育，显影、定影后冲洗并扫描胶片。Band-Scan软件分析胶片灰度值。

1.6 统计学方法 采用SPSS18.0软件统计。采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠线粒体形态比较 与DS组相比，DIR组线粒体严重空泡化伴肿胀；与DIR组相比，DIR+Mel组线粒体空泡化和肿胀减轻；与DIR+Mel组相比，DIR+Mel+3-TYP组线粒体空泡化和肿胀加重。

2.2 各组小鼠病灶脑组织线粒体氧化应激指标比较 见表1。

表1 各组小鼠病灶脑组织线粒体MDA含量、SOD活性、CAT活性比较（±s）

表1 各组小鼠病灶脑组织线粒体MDA含量、SOD活性、CAT活性比较（±s）

注：与DS组相比，aP＜0.05；与DIR组相比，bP＜0.05；与DIR+Mel组相比，cP＜0.05。

CAT活性（U/mg）8.32±0.98 3.45±0.71a 7.12±0.72b 4.12±0.57ac组别DS组DIR组DIR+Mel组DIR+Mel+3-TYP组n 6 6 6 6 MDA（nmol/mg）4.23±1.21 15.71±1.93a 8.56±1.47ab 13.09±1.62abc SOD活性（U/mg）141.95±15.47 49.53±11.60a 108.19±18.15ab 80.26±14.81abc

2.3 各组小鼠病灶脑组织线粒体ATP含量及线粒体生成因子表达比较 见表2。

表2 各组小鼠病灶脑组织线粒体ATP含量及NRF1、TFAM、Cyt-Cyto C表达比较（±s）

表2 各组小鼠病灶脑组织线粒体ATP含量及NRF1、TFAM、Cyt-Cyto C表达比较（±s）

注：与DS组相比，aP＜0.05；与DIR组相比，bP＜0.05；与DIR+Mel组相比，cP＜0.05。

组别DS组DIR组DIR+Mel组DIR+Mel+3-TYP组Cyt-Cyto C 1.00±0.21 2.23±0.32a 1.47±0.24ab 1.93±0.29ac n 6 6 6 6 ATP含量95.57±13.67 44.61±10.10a 75.76±11.43ab 54.60±11.06ac NRF1 1.00±0.14 0.40±0.11a 0.75±0.12ab 0.51±0.17ac TFAM 1.00±0.15 0.44±0.13a 0.77±0.11ab 0.54±0.16ac

3 讨论

糖尿病是缺血性脑卒中重要且独立的危险因素。对于血糖控制不佳的糖尿病患者，其心脏病和缺血性脑卒中的发生风险均显著升高，因此有学者认为血糖水平可作为衡量糖尿病患者心脑血管疾病发生风险的重要预测指标之一[8]。流行病学资料显示，1型糖尿病患者缺血性脑卒中的发生率远高于2型糖尿病患者，且1型糖尿病合并缺血性脑卒中患者脑损伤程度更加严重[9]。同时，临床研究发现，糖尿病患者严格的血糖控制并不能有效降低缺血性脑卒中的发生风险，也未能有效延缓缺血性脑卒中的进展，一些有益于非糖尿病CIRI患者的救治策略用于糖尿病CIRI患者效果也并不理想[10]。

研究表明，高糖可加重CIRI，同时影响药物等各种干预措施对CIRI的治疗作用[11]。近年来，线粒体作为神经退行性疾病的主要治疗靶点受到越来越多的关注。线粒体作为“能量中枢”，是具有独特组织特异性的动态多功能细胞器，参与神经可塑性及神经元凋亡等过程[12]。同时线粒体也是细胞内ROS的主要来源，对各类应激反应均十分敏感，一旦氧化应激失衡，可导致线粒体损伤并形成恶性循环[13]。与其他细胞相比，神经元需要消耗更多的能量，但储备却十分匮乏。若发生CIRI，神经元能量产生所需底物会被迅速耗尽进而诱发线粒体损伤[14]。有证据表明，再灌注期间由于线粒体损伤，众多促生存的级联反应被抑制，进而导致缺血神经元损伤加重[15]。因此，维护线粒体形态和功能正常是糖尿病CIRI的潜在治疗策略。

Sirtuins蛋白家族是一群保守的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶（HDACs），其可通过调节多种转录因子、酶和蛋白质，在基因转录、基因组稳定性、糖脂代谢和寿命调控等过程中发挥重要作用[16]。SIRT3作为线粒体Sirtuins的主要亚型，近年来备受研究者的重视。SIRT3通过调节线粒体氧化应激水平，在细胞内脂肪酸氧化和ATP合成中发挥重要作用[17]。新近研究发现，SIRT3作为调控氧化应激和维持能量稳态的关键，抑制SIRT3可导致线粒体运输障碍，ROS增多，能量匮乏，再灌注损伤加重；激活SIRT3可增加线粒体生成，加快ROS清除，是机体内源性保护的关键[18]。本研究结果显示，糖尿病CIRI后线粒体出现严重空泡化和肿胀，同时线粒体MDA水平增加，SOD、CAT活性降低，ATP含量减少，线粒体生成因子NRF1、TFAM表达降低，Cyt-Cyto C表达升高，提示线粒体结构和功能受损、线粒体生成障碍是糖尿病CIRI加重的关键机制之一。

褪黑素作为一种内源性的吲哚胺分子，主要由松果体合成。褪黑素的合成和分泌随着年龄增长而减少，其相对缺乏可能与年龄相关的神经退行性疾病的发生发展有关[19]。褪黑素缺乏的大鼠在脑卒中后表现出更严重的脑损伤或兴奋性毒性癫痫发作[20]。研究表明，褪黑素在非糖尿病CIRI中具有神经保护作用[21]。新近研究发现，褪黑素亦可在包括糖尿病在内的各种病理条件下维持线粒体稳态，保护线粒体免受损伤[22]。本研究结果显示，在再灌注之前给予褪黑素治疗可维持线粒体形态，降低线粒体氧化应激水平，增加ATP供能，同时促进线粒体生成，进而显著减轻神经损伤。当特异性抑制SIRT3后，上述神经保护功能被削弱。这提示褪黑素可能通过激活SIRT3，介导线粒体保护，进而减轻糖尿病CIRI。

综上所述，褪黑素干预可维持糖尿病CIRI小鼠线粒体正常形态，降低线粒体氧化应激水平，增加ATP含量，促进线粒体生成，作用可能与调控SIRT3表达有关。