响应面法优化黑木耳新品种森盛1号液体发酵条件

解修超， 贾 娇， 宋 玉， 谢海彬， 邓百万， 孙 娅， 徐易洁

(1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723000； 2.陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西汉中 723000；3.汉中植物研究所，陕西汉中 723000)

黑木耳()作为担子菌门中重要的药食同源真菌，含有丰富的氨基酸、多糖、黑色素和维生素等成分，具有增强机体免疫功能、补血、补脑、抗衰老、抗凝血和抑制肿瘤生长等保健效果和药用功效，是维持人体健康的绝佳食材。近年来，随着“菌粮”等新名词的出现，黑木耳在人类健康重要性中的体现越为明显。

黑木耳作为食药两用真菌，在我国的国民经济、人类健康中展现出巨大的开发前景。从药用角度来讲，主要是黑木耳天然药物活性成分的提取、分离纯化以及相关药品、保健品的开发等；然而，目前市场上的相关药品甚少，部分产品只是局限于动物试验测试。从食用角度来讲，我国是世界黑木耳产量最多、食用最多的国家。近年来，黑木耳已成为我国栽培量第二大的食用菌品种，但各个产地生产的黑木耳品质参差不齐，具有优良性状的黑木耳新品种更是少见。

秦巴山区是我国黑木耳的主要产地之一，其独特的温润气候条件造就了当地黑木耳“质厚、肉嫩、味美”的品质。黑木耳是秦巴山区主栽食用菌之一，该地区现在的传统栽培方式相较于近年来发展的液体种栽培技术显得十分低效，在一定程度上限制了区域产业经济的发展。研究表明，食用菌液体菌种的生产周期短、菌龄整齐、接种简便、接种点多、发菌快且不易污染，是解决栽培效率低下的有效途径之一。目前，有关黑木耳液体发酵工艺的报道甚少，并且由于菌种、培养条件及其优化方法等因素的差异，所得到的液体菌种品质的差别较大。唐业刚采用单因子试验和正交试验对毛木耳998菌种液体发酵条件进行优化试验，所得菌丝转化量干质量为15.17 g/L。谢意珍等利用正交试验对黑木耳AU-5菌种液体发酵条件进行优化试验，所得菌丝转化量干质量为26.5 g/L。研究表明，相较于正交方法，响应面方法能真实地反映各影响因素间的交互作用，并能得到较好的试验结果。

本研究以黑木耳新品种森盛1号为试验材料，在前期研究的基础上，拟先通过Plackett-Burman试验从可能影响其菌丝生物量的9个因素[马铃薯含量、葡萄糖含量、麦麸含量、蛋白胨含量、磷酸二氢钾(KHPO)含量、七水硫酸镁(MgSO·7HO)含量、初始pH值、接种量、温度]中筛选出显著性因素；再通过最陡爬坡试验得到最佳响应区域；最后采用Box-Behnken设计对显著性因素做响应面试验，并通过分析和验证得到最优的液体发酵工艺条件，为黑木耳或其他食用菌的液体菌种生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 森盛1号黑木耳菌株由陕西省食药用菌工程技术研究中心选育。

1.1.2 主要试剂 葡萄糖、KHPO、MgSO·7HO等均为分析纯，马铃薯和麦麸(均为食品级)市购，蛋白胨和琼脂购自北京百奥莱博科技有限公司，试验用水为纯化水。

1.1.3 主要仪器 LS-B50L型高压蒸汽灭菌锅(上海医用核子仪器厂)、ZHWY-2102C型数显式恒温摇床(上海志成有限公司)、TB-214型电子分析天平(北京赛得利斯仪器系统有限公司)、LRH-250-GS型数显式恒温培养箱(广东省医疗器械厂)、101A-3E型电热鼓风干燥箱(上海试验仪器厂有限公司)、SW-CJ-1F型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.1.4 培养基 固体培养基(CPDA)：液体母种培养基，为不添加琼脂的CPDA培养基；基础发酵培养基：马铃薯(去皮)200.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、麦麸10.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、KHPO2.0 g/L、MgSO·7HO 1.0 g/L，初始pH值自然。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化及其液体母种的制备 将森盛1号黑木耳菌株接种于PDA斜面，28 ℃培养至满管，备用。取0.5 cm大小的斜面菌块接种于液体母种培养基，静置24 h后于28 ℃、170 r/min振荡培养 6 d 备用。

1.2.2 菌丝干质量的测定 抽滤收集菌丝体，纯化水洗涤3～5次后，60 ℃烘干至恒质量，电子分析天平称质量。

1.2.3 Plackett-Burman试验 根据前期预试验选定适合森盛1号菌株生长的基础发酵培养基，并根据培养基组成和发酵条件选取9个因素(马铃薯含量、葡萄糖含量、麦麸含量、蛋白胨含量、KHPO含量、MgSO·7HO含量、初始pH值、接种量、温度)作为研究对象，设计Plackett-Burman试验，各因素取值见表1。根据各试验组中不同因素组合配制培养基(每组设置3个重复)，接液体母种并静置 24 h，振荡培养8 d后测定菌丝干质量，取平均值，结果借助Minitab 19软件进行统计分析。

表1 Plackeet-Burman试验设计各因素及水平

1.2.4 最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman试验设计中各个显著影响因素效应的大小，确定对菌丝干质量影响显著的因素。其中，影响显著的正效应因素的值逐渐增加，影响显著的负效应因素的值逐渐减小，设计最陡爬坡试验方案，使结果逼近最佳响应区域。

1.2.5 Box-Behnken试验及回归模型分析 在最陡爬坡试验基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，采用A(葡萄糖含量)、B(KHPO含量)、C(初始pH值)进行3因素3水平的响应面试验。试验因素水平编码见表2。采用Design-Expert 12.0软件对Box-Behnken试验结果进行分析并建立回归模型，根据模型预测其最佳工艺条件组合。

乔十二郎是一个瘦弱少年，沉默寡言，初一看并不起眼，然而目光坚毅，异乎常人，更为奇特的是，额头被宽宽的布带缠着。秦铁崖看看对方眉眼，一边眼角偏高，随即推测出对方额角曾被焰火烧伤，留下永久疤痕，疤痕愈合不好，把一边眼角牵引上去。这么想时，秦铁崖心头有些沉重。算起来，这孩子才十四岁。

表2 3因素3水平Box-Behnken试验设计

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验结果

选用试验次数=12的 Plackett-Burman试验设计方案，考察、等9个因素(每个因素取2个水平)对菌丝干质量的影响，结果见表3和表4。

表3 Plackeet-Burman试验设计及响应值

从表3和表4可以看出，对森盛1号菌丝干质量影响的显著因素分别是葡萄糖含量()、KHPO含量()、初始pH值()。其中，、增加时，菌丝干质量显著增加(<0.05)，为正效应因素；而增加时，菌丝生物量显著降低，为负效应因素。另外，蛋白胨含量、温度、麦麸含量增加时，菌丝干质量有一定增加，其取值应为高水平(表1)；接种量、马铃薯含量、MgSO·7HO含量增加时，菌丝干质量量反而减少(>0.05)，其取值应为低水平(表1)。因此，选取不显著因素(马铃薯200.0 g/L、蛋白胨4.5 g/L、麦麸15.0 g/L、MgSO·7HO 1.0 g/L、温度28.0 ℃、接种量4%)为发酵工艺的基本参数，将显著性因素(葡萄糖含量、KHPO含量和初始pH值)作为最陡爬坡试验的考察对象。

表4 Plackett-Burman试验分析结果(已编码单位)

2.2 最陡爬坡试验结果

响应面拟合只有先逼近最佳响应区域才能最好地反映真实情况，将、逐步增加，逐步减小，最陡爬坡试验结果详见表5。

表5 最陡爬坡试验设计及结果

从表5可以看出，随着、逐步增加，以及逐步减小，森盛1号菌丝干质量呈现先增大后减少趋势。当葡萄糖含量45.0 g/L、KHPO含量 4.5 g/L、pH值4.5时，森盛1号菌丝干质量达到最大(13.1 g/L)。因此，第4组为最佳响应区域，可作为Box-Behnken试验的考察对象。

2.3 Box-Behnken试验结果

以A(葡萄糖含量)、B(KHPO含量)和C初始(初始pH值)为考察对象，根据Box-Behnken原理和表2，设计3因素3水平的响应面试验，考虑各因素间的交互作用对森盛1号菌丝干质量的影响，试验及分析结果见表6和表7。

表6 Box-Behnken试验结果

采用Design Expert 12.0软件对17个试验点的菌丝干质量()进行回归统计分析，得出二次模型回归统计分析表(表7)。

表7 回归分析结果

=2026+169+242+269+11725-108+0335-4125-3848-3603。

2.4 响应曲面分析

根据回归方程绘制随各因素(葡萄糖含量、KHPO含量和初始pH值)变化的响应曲面图，当响应面图的坡度越陡峭时，等高线越密集，等高线呈扁圆形时，两因素交互作用较显著。由此分析，葡萄糖含量、KHPO含量和初始pH值等3个因素对菌丝干质量的影响(图1、图2、图3)。每个响应曲面分别代表着2个独立因素间的相互作用，其余因素均保持在编码水平的0水平。

由图1可知，A和B的交互作用较显著；会随着A和B的增加先增加后降低，其中葡萄糖含量起着主要作用。

由图2可知，A和C的交互作用较显著；A和C的值在低水平时，基本不变；A在一定的水平下，随C的增加，呈缓慢增加趋势；相比较于C在低水平时，C在高水平时随A的增加，增加迅速，但最终的仍然比C在高水平时要小。可见，大量葡萄糖的存在在一定程度减少了较高初始pH值对黑木耳菌丝生长的抑制作用。

由图3可知，B和C的交互作用不显著，但随2因素值的增加呈先升高后降低趋势。

2.5 最佳工艺条件的验证

综合以上研究，由回归模型得到，影响Y的各因素最优值：葡萄糖50.27g/L、KHPO4.93 g/L、初始pH值5.1，此时的最大预测值为21.2 g/L。为了检验该工艺的可靠性，采用上述最优条件进行验证试验，得到的验证值为21.57 g/L，与最大预测值(21.2 g/L)非常接近，相对误差仅为1.75%，小于5%。因此，Box-Behnken响应面法在森盛1号黑木耳液体发酵工艺优化中的应用是成功的。

3 结论与讨论

本研究采用Plackett-Burman、最陡爬坡、Box-Behnken响应面以及验证试验对森盛1号黑木耳新品种的液体发酵工艺进行了优化，得到了最优的发酵工艺条件：马铃薯200.0 g/L、葡萄糖50.27g/L、蛋白胨4.5 g/L、麦麸15.0 g/L、KHPO4.93 g/L、MgSO·7HO 1.0 g/L、初始pH值 5.1、接种量4%、温度28.0 ℃、160 r/min摇床发酵8 d，菌丝干质量可达到21.57 g/L，比优化前提高了23.53%。

响应面相较于其他优化方法，可以反映碳氮源等因素间的交互作用。与钱雪婷等的研究结论进行比较，与“葡萄糖是影响黑木耳菌丝生物量的显著性因素”的结论相同，这是由于在发酵初期黑木耳菌株不能产生分解复杂有机物的酶系，而单糖更容易得到吸收利用；与结论“影响黑木耳菌株神农A8干质量顺序为KHPO含量>葡萄糖含量>牛肉粉含量”不同，影响菌丝干质量的顺序是初始pH值>KHPO含量>葡萄糖含量，可能是由菌种的差异导致；从液体菌种的实际生产来看，较高的菌丝生物量是判断液体菌种质量的一个重要标准，森盛1号在最优发酵工艺条件下的菌丝干质量比神农A8多94%，可见新品种森盛1号具有更大优势。

另外，响应面分析得到的二次回归模型可以较好地反映试验的真实结果。本研究得到的菌丝干质量验证值(21.57 g/L)与最大预测值(21.2 g/L)较接近，相对误差仅为1.75%(<5%)。因此，优化得到的森盛1号黑木耳液体发酵工艺是有效可行的，可为森盛1号新品种及其他黑木耳菌株的液体菌种生产提供科学依据。