连作对辽细辛土壤理化性质和根际微生物群落特征的影响

于春雷， 高 嵩， 孙文松

(1.辽宁省经济作物研究所，辽宁辽阳 111000； 2.辽宁省农业科学院药用植物研究所，辽宁辽阳 111000)

辽细辛[Fr. Schmidt var.(Maxim.) Kitag.]为马兜铃科细辛属，别称北细辛、烟袋锅花、东北细辛、细参等，多年生草本药用植物。有祛风散寒、通窍、止痛、温肺、化饮功效。用于风寒感冒、头痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、风湿痹痛等。

截至2019年底，辽宁省抚顺市新宾县辽细辛种植面积达1 800 hm，细辛饮片年产量2 100 t，年综合产值达3亿元。辽细辛等中药材产业已成为促进新宾县农业增效和区域经济发展的核心产业。辽细辛为宿根药用植物，其土壤经过一茬种植后需要进行轮作其他作物。然而受生长年限、道地产区土地资源紧张和农民种植习惯等因素影响，实际生产中往往重茬栽种辽细辛。导致辽细辛出现存苗率大幅度下降、病虫害严重等诸多问题，甚至绝产，辽细辛生产中的连作障碍问题已经严重限制产业可持续发展。

连作后土壤肥力下降、自毒物质积累、微生态失调是连作障碍形成的主要原因。研究表明，连作体系下土壤微生物多样性及结构发生变化，进而影响土壤生产力。土壤细菌是土壤养分循环重要的驱动者，具有重要的生态功能。有研究表明，土壤真菌群落参与关键的生态过程，包含大量土传病害的致病因子及拮抗因子。因此，土壤细菌真菌群落在根际微生态、病虫害防控以及科学施肥方面，扮演重要角色。然而关于辽细辛根际微生物群落变化的研究很少，加强根际细菌真菌群落的研究来阐述辽细辛连作障碍机制非常必要。

本研究以辽宁省抚顺市新宾县不同生长年限辽细辛的根际土壤为研究对象，采用Illumina Miseq高通量测序技术分析根际微生物群落的组成及多样性差异，分析辽细辛土壤速效养分的年际变化，并探究细菌与真菌群落年限变化与土壤理化性质的关系，为缓解辽细辛连作土壤细菌代谢潜力、防治真菌病害提供参考，研究结果旨在从土壤微生物微生态关系方面为辽细辛的生产实践提供科学支撑。

1 材料与方法

1.1 根际土壤样品采集

本次研究对象为辽宁省抚顺市新宾县北四平村(125°19′44.33″N，41°80′51.8″E)山地的栽培辽细辛，采集地辽细辛的生长过程中水肥管理一致。于2019年9月进行土壤样品采集，种植年限分别为2年实生苗移栽1、2、3、4年的辽细辛根际土壤(XX3、XX4、XX5、XX6)，试验小区随机排放且面积为1.2 m×5.0 m。按“S”形每个小区随机选取5株辽细辛，采用“抖根法”收集根际土壤，同时在采样区域50 m内采集未种过辽细辛的园土作为对照(CK)，共计5个样品，3次重复。去除杂质后，过 2 mm 无菌筛网，1份用于土壤微生物群落鉴定，1份用于理化性质的测定。

1.2 土壤理化性质分析

土壤理化指标均按照《土壤农化分析》中的方法测定：pH值采用酸度计法测定，土壤有机碳含量采用浓硫酸-重铬酸钾外加热法测定，硝态氮含量采用碱解扩散法测定，速效磷含量采用碳酸氢钠浸提钼锑抗比色法测定，速效钾含量采用乙酸铵浸提火焰光度计法测定。

1.3 土壤DNA的提取和高通量测序

采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法提取土壤基因组DNA。ITS1区引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)用于鉴定真菌多样性；使用引物(338F和806R)对采集土壤样品中16S rDNA的 V3-V4 高变区进行 PCR 扩增，用于鉴定细菌多样性。使用赛默飞世尔科技公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测合格后，进行上机测序。

1.4 数据分析与处理

使用Qiime软件计算辛普森指数、香农指数、ACE指数、Chao1指数等多样性指数。使用R软件绘制曲线，计算物种累积曲线，进行Alpha多样性指数差异分析。利用Uparse软件对所有样品的全部Clean Reads进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，同时选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。利用SPSS 2.0软件进行数据统计分析，相关性分析。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质分析

与对照未种植辽细辛土壤相比，辽细辛根际土壤理化性质如表1所示，连作会对土壤理化性质产生不同影响。连作使土壤pH值降低，有机质含量逐年下降。碱解氮、速效磷和速效钾含量从移栽1年后开始增加，移栽2年含量达到峰值，移栽3、4年再次逐年降低，种植辽细辛的土壤碱解氮含量均显著高于对照，速效磷和速效钾含量低于对照土壤。

表1 不同种植年限土壤理化性质

2.2 辽细辛不同年限根际土壤细菌和真菌多样性分析

辽细辛根际土壤16S rDNA测序共获得381 857条可分类的细菌序列，样本数量范围为59 989～86 192 条；ITS1测序获得679 865条可分类的真菌序列，样本数量范围在55 475～80 162条。由表2可知，各土壤样品细菌和真菌测序深度指数覆盖率均高于99.1%，表明本次测序能够较准确地反映样品中微生物的真实情况。香农指数和辛普森指数结果表明，与种植辽细辛的根际土壤相比，对照土壤的细菌和真菌多样性均较之丰富，可能是由于辽细辛根系对根际土壤微生物的选择性引起；随种植年限增加多样性指数整体均呈现明显下降趋势，连续种植的辽细辛土壤多样性各项指数均显著低于其他年限土壤，说明连作能降低土壤微生物的多样性，使土壤微生物群落种类数量降低且趋于单一化。

表2 辽细辛根际土壤细菌和真菌群落丰富度及多样性指数

2.3 辽细辛根际土壤细菌和真菌群落结构分析

2.3.1 细菌群落结构分析 不同年限辽细辛根际土壤中细菌分属于36个门、46个纲、96个目、161个科、282个属。由图1所示，辽细辛根际土壤中细菌在门水平上具有较高的多样性，不同年限根际土壤相对丰度排名前十的细菌门分别为：变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)。随着连续种植年限的增加，变形菌门和拟杆菌门相对丰度明显增加，放线菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门相对丰度明显降低。

如图2所示，不同年限辽细辛根际土壤细菌丰度在属分类水平上表现出明显的差异性。与对照相比，移栽4年的根际土壤细菌相对丰度差异性最明显。移栽4年的优势菌属有嗜酸菌属()、节杆菌属()、罗河杆菌属()、褚氏杆菌属()和属等；而对照未种植辽细辛土壤中丰度最高的优势菌群为属、诺卡氏菌属()、地杆菌属()等，2个处理的优势菌属与非优势菌属呈现相反趋势。除上述相对丰度变化巨大的菌属外，一些菌属在移栽4年后丰度呈现降低趋势，如芽单胞菌属()、_属、鞘氨醇单胞菌属()、属、属、unidentified_Gemmatimonadaceae。

2.3.2 真菌群落结构分析 不同年限辽细辛根际土壤中真菌分属于14个门、38个纲、81个目、136个科、194个属。由图3所示，辽细辛根际土壤中真菌主要分布于：粪壳菌纲(Sordariomycetes)、被孢霉纲(Mortierellomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、伞菌纲(Agaricomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)、Rozellomycotina_cls_Incertae_sedis、微球黑粉菌纲(Microbotryomycetes)等。其中粪壳菌纲为优势真菌菌群，占比分别为XX4(41.12%)>XXCK(29.90%)>XX3(26.51%)>XX5(20.30%)>XX6(9.45%)，在移栽2年时相对丰度占比较对照有所升高，但整体变化趋势为随种植年限增加丰度递减。另一优势真菌菌群被孢霉纲相对丰度占比随种植年限增加呈现起伏型变化趋势，XX5(23.37%)>XX3(18.43%)>XXCK(16.21%)>XX4(15.67%)>XX6(6.96%)。而银耳纲Tremellomycetes则表现为种植年限越长占比越高，XX6(20.83%)远高于其他年限。

如图4所示，真菌在属分类水平上，丰度随种植年限增加显著增加，移栽4年的根际土壤到达顶峰的优势菌属有粘帚霉属()、土赤壳属()、白冬孢酵母属()、假丝酵母菌属()等。一些菌属在移栽4年后丰度显著降低，在未种植辽细辛土壤中丰度优势菌属有被孢霉属()、镰刀菌属()、属、圆孢霉属()、毛壳菌属()、青霉属()、属、属、篮状属()。

2.3.3 真菌群落结构UPGMA 聚类分析 为了研究不同种植年限间土壤真菌群落的相似性，利用Unweighted Unifrac距离矩阵对不同处理真菌群落进行UPGMA聚类分析，构建聚类树。如图5所示，辽细辛根际土壤真菌的遗传距离存在一定的差异，未种植辽细辛土壤和XX3辽细辛土壤遗传距离很近，聚为一类，真菌群落结构具有较高的相似性。XX6辽细辛土壤较其他处理最远，单独聚为一类，真菌群落结构与其他处理比较相似性较低。说明随种植年限增加，辽细辛土壤真菌群落结构发生改变。

2.4 土壤理化性质与微生物多样性的相关分析

如表3、表4所示，辽细辛土壤理化性质与根际土壤微生物α多样性指数的相关性分析表明，细菌多样性指数与土壤pH值、有机质含量、有效磷含量和速效钾含量呈正相关；与碱解氮含量呈负相关，其中与辛普森指数呈显著负相关。真菌多样性指数与土壤pH值、有机质含量、有效磷含量和速效钾含量呈正相关，其中香农指数与速效钾含量呈显著正相关；与碱解氮含量均呈负相关，其中与香农指数和辛普森指数达到显著负相关。

表3 辽细辛土壤理化性质与土壤细菌α多样性指数的相关关系

表4 辽细辛土壤理化性质与土壤真菌α多样性指数的相关关系

2.5 土壤理化性质与微生物优势类群的相关分析

如表5、表6所示，对不同年限辽细辛根际土壤细菌和真菌优势菌(属水平)丰度与土壤理化性质进行相关性分析。结果表明， 几乎所有真菌都与碱解氮含量呈负相关关系，其中毛壳菌属和镰刀菌属与碱解氮含量有显著的负相关性(<0.05)，菌刺孢属、属和土赤壳属与碱解氮含量呈极显著负相关性(<0.01)，说明在本研究中碱解氮含量是土壤真菌群落最主要的影响因子。

表5 辽细辛土壤理化性质与土壤真菌优势菌(属水平)的相关关系

表6 辽细辛土壤理化性质与土壤细菌优势菌(属水平)的相关关系

在土壤细菌优势群落组成与土壤理化性质的相关分析中发现，土壤有效磷、速效钾以及有机质含量与辽细辛根际土壤细菌大部分优势菌间表现较强的相关性，说明土壤有效磷、速效钾和有机质含量是改变土壤细菌群落组成的主控因子。属与有效磷和速效钾含量呈显著正相关(<0.05)，属与有机质含量呈显著负相关(<0.05)，unidentified_Gemmatimonadaceae与有效磷含量呈显著负相关(<0.05)，与有效磷含量呈显著负相关(<0.05)，热酸菌属与有机质含量呈显著负相关(<0.05)。

3 结论与讨论

3.1 种植年限对辽细辛根际土壤细菌和真菌群落多样性的影响

由于多年连续种植，土壤肥力逐年下降，导致土壤理化性质发生改变，微生物群落多样性降低，存在潜在的土壤肥力衰退趋势。土壤微生物群落多样性是反映土壤健康情况的重要指标，本研究发现由于辽细辛连续种植，土壤pH值逐年下降，酸性增加，影响微生物群落多样性改变。由于逐年施肥，辽细辛种植土壤中碱解氮含量呈先增后降的趋势，高于未种植辽细辛土壤。这与龙胆草连作和辣椒连作上的研究相一致。种植辽细辛的土壤速效钾含量表现为低于对照土壤，辽细辛生长消耗钾元素较多，这与在当归上的研究结果相一致。

目前研究认为，土壤pH值能够影响土壤微生物群落结构。对龙胆草连作土壤研究发现，土壤的pH值随种植年限增加逐渐降低，且土壤硝化速率与土壤pH值显著负相关，说明土壤酸化影响了土壤的氮素循环过程。枸杞园连作研究发现，与对照相比连作土壤碱解氮含量显著升高，连作影响土壤的硝化和反硝化过程。本研究与上述研究结论一致，辽细辛土壤pH值随种植年限增加降低，土壤碱解氮含量逐渐降低，但显著高于对照土壤。研究结果表明，辽细辛土壤碱解氮含量与根际土壤细菌辛普森指数呈显著负相关；真菌香农指数与速效钾含量呈显著正相关，香农指数和辛普森指数与碱解氮含量呈显著负相关。茶园土壤中，氨氧化古菌是酸化土壤中硝化作用的主要驱动因子，但在辽细辛连续种植条件下，土壤硝化和反硝化过程以及氮素循环过程仍需进一步研究。

本研究发现由于辽细辛对磷肥、钾肥需求量大，土壤中速效磷、速效钾含量整体均逐年下降，且远低于对照含量。磷元素是限制植物生长的关键元素，在土壤中多以不溶或者难溶的复杂化合物形式存在，不易被植物吸收利用。土壤解磷微生物，如假单胞菌属、芽孢杆菌属、曲霉素以及青霉素等能够通过溶解或者矿化过程释放土壤中的有机磷和无机磷供植物吸收，杨树连作研究表明，土壤磷含量随连作时间的加长而逐步降低，且土壤解磷菌的丰度与土壤pH值呈显著正相关。本研究表明，连续种植辽细辛使土壤pH值降低，反而增加了土壤磷的有效性；从解磷微生物相对丰度变化发现，属的丰度变化与有效磷含量呈显著正相关。在辽细辛的连续种植模式下，土壤中的磷循环过程及微生物群落多样性可能与土壤pH值变化相关。对于连续种植辽细辛影响土壤微生物群落功能的变化规律仍需利用宏基因组、宏转录组及土壤酶活性等从不同角度进行解析验证。

3.2 种植年限对辽细辛根际土壤细菌和真菌群落结构的影响

土壤微生物群落结构受种植作物的影响。连作后，由于根系分泌物积累，土壤微生态环境发生改变，细菌和真菌组成和丰度均有差异。在细菌水平上，本研究发现随着辽细辛种植年限增加，根际土壤中细菌变形菌门和拟杆菌门相对丰度明显增加，放线菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门相对丰度明显降低。苜蓿连作研究有同样结果，土壤放线菌门相对丰度显著高于农田土壤，且随种植年限延长降低。放线菌在纤维素、半纤维素降解以及果胶和木质素转化中起最主要的作用，为土壤提供养分且可以分泌多种抗生素类物质。同时放线菌还具有解磷作用，其相对丰度对于土壤磷含量具有一定的指示作用，随着辽细辛种植年限增加，植物自身的生理代谢逐渐减弱，根系生长和活力会有一定程度下降，辽细辛化感作用增强导致土壤中可利用资源下降，进而对微生物群落结构造成影响。本研究中细菌门水平上，变形菌门相对丰度逐年增加，为最优势菌群，这与苜蓿、枸杞等研究结果一致。变形细菌能够利用有机物分解产生的氨气、甲烷等营养物质进行生长代谢活动，变形菌可利用有机碳为土壤提供固氮能力，且对农田土壤养分循环有明显的促进作用。在细菌属水平上，有嗜酸菌属、节杆菌属、罗河杆菌属、褚氏杆菌属和等优势菌属，连续种植处理显著高于未种植对照处理。而、诺卡氏菌属、地杆菌属等优势菌群在对照土壤中丰度最高。预测连作干扰辽细辛与土壤微生物间的互相作用，影响辽细辛根际益生菌和致病菌群间的平衡关系，但细菌及其丰度变化所导致的生态系统功能改变仍需进一步研究。

大量研究表明，真菌群落结构受连作影响。在对华中五味子的研究中发现，随着栽培时间增加，优势真菌数量增加，非优势真菌种数量逐渐减少直至消失，真菌种类和分布产生显著差异，进而影响真菌的种群结构和代谢功能多样性，导致土壤真菌群落多样性降低，本研究结果与之相一致，粪壳菌纲为优势真菌菌群，随年限增加呈现递减趋势。另一优势真菌菌群被孢霉纲同样呈现随年限增加而降低趋势。而银耳纲则表现为种植年限最长占比更高，远高于其他处理。本研究发现在连续种植的根际土壤中达到顶峰的优势菌属有粘帚霉属、土赤壳属、白冬孢酵母属等。木霉菌为有益菌，一般多存在健康土壤和对照土壤中，本研究木霉菌随种植年限增加可能是由于种植中不断施加木霉菌肥的原因。一些菌属在连续种植后丰度显著降低，在未种植辽细辛土壤中丰度优势菌属有被孢霉属、镰刀菌属、、圆孢霉属、毛壳菌属、青霉属、、、篮状属。镰刀菌为致病菌，会造成中药材根腐病的发生。已有研究发现，土赤壳属归属于子囊菌门的肉座菌目，具有降解腐烂有机质，降解纤维素的作用。被孢霉属作为土壤中的有益菌，起到溶解土壤中磷的作用，此外通过提供氮营养以及提高植物的抗病性，促进植物的生长。属水平分析结果表明，随着辽细辛种植年限的增加，优势真菌一直在变动，其中，镰刀菌属、被孢霉属、毛壳菌属的生长受到抑制，一定程度上改善了辽细辛根际土壤环境，提高了土壤的健康水平，促进了辽细辛植株的生长发育。本研究对土壤真菌群落与土壤理化性质的相关分析发现，随着辽细辛种植年限增加，土壤性质与真菌群落间具有一定的相关性，其中毛壳菌属和镰刀菌属与碱解氮含量有显著的负相关性，菌刺孢属、和土赤壳与碱解氮含量呈极显著负相关，这与在茶树上的研究结果类似。土壤中的氮元素等对真菌群落有显著影响，通过调节土壤养分，可以改变根际土壤真菌群落组成和遗传多样水平。