桑叶非腺毛显微特征常数的测定

史　锐　黄晓彤　丛龙娇　刘斯文　王琪瑶

桑叶非腺毛显微特征常数的测定

史锐黄晓彤丛龙娇刘斯文王琪瑶

（辽宁中医药大学药学院辽宁沈阳110000）

为优化桑叶的显微定量方法，文章测定了12个品种桑叶非腺毛的显微特征常数，以便于鉴别不同品种桑叶药材，为桑叶的质量评价提供基础，试验以桑叶的非腺毛作为显微特征结构，运用容量分析法优化均匀设计实验条件，测定不同品种桑叶非腺毛结构的显微特征常数。研究结果表明，不同品种桑叶非腺毛的显微特征常数具有一定的差异性，范围在61.6个/mg～415.7个/mg。实验证实利用显微定量法测定桑叶非腺毛的显微特征常数来作为评价桑叶质量的标准是可行的、科学的，为后续研究提供了参考。

桑叶；显微定量；均匀设计；质量评价

桑叶为桑科桑属植物桑（L.）的干燥叶，又称“神仙叶”“铁扇子”等[1]。桑叶味甘、苦，性寒，归肝、肺经[2]，具有清热解毒、通血下气、利五脏关节、祛风凉血、清肝明目、清肺润燥等功效[3]，主要用于治疗目赤昏花、肺热燥咳等病症[4]。现代研究表明，桑叶中化学成分种类十分丰富，主要包括黄酮类[5]、生物碱类[6-8]和多糖[9]等，具有降血糖[10-11]、消炎等多种药理作用，被广泛应用于临床。桑叶的显微结构中栅栏组织多与表皮细胞相连，且不同种桑叶中栅栏组织数量相差无几；螺纹导管少见；草酸钙簇晶和方晶的数量众多，且结构多重合，难以区分；细胞组织与含钟乳体的大型晶细胞数量极少；其中非腺毛的结构较为完整且粗壮，特征较为明显，容易观察，故选择桑叶药材中的非腺毛显微结构作为显微特征物测定桑叶的显微特征常数。

显微定量法[12]是根据药材中一种特定的显微结构具有固定常数的特点，主要采用容量分析法或重量分析法评价药材质量的中药鉴定方法[13]，在中药研究领域使用较广泛，最常用于中药材的含量测定。此外，显微定量法[14]在易混淆的中药鉴定和中药材的质量评价中的应用也较为广泛，中药材显微结构的显微特征常数与药材中活性成分的相关性研究也有一定的进展。桑属在我国约有11个品种，在我国各个区域均有分布，因为桑叶品种繁多，导致其入药品种不明确，这严重制约了桑叶的开发利用。利用显微定量法测定桑叶非腺毛的显微特征常数，丰富了桑属中桑叶的鉴别方法，创新了评价桑叶药材质量的方式，为中药的质量鉴定开辟新的途径。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

药材：实验选取桑叶药材中，鸡桑、垂枝桑、广东桑、长果桑、山桑、鲁桑、白桑、华桑、蒙桑、瑞穗桑采集于江苏镇江，新疆白桑、药桑采集于新疆和田，以上品种桑叶样品经辽宁中医药大学康廷国教授鉴定为桑科桑属桑树（L.）的叶子。

试剂：水合氯醛与甘油（天津大茂化学试剂厂，批号：20200907），蒸馏水（娃哈哈集团）。

1.2 仪器与设备

实验仪器及设备包括Olympus光学显微镜（上海普赫光电科技有限公司）、电子分析天平（上海精宏实验设备有限公司）、FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器设备有限公司）、KQ5200DB型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）、微量移液器（绍兴市上虞英华贸易有限公司）、中药筛子（绍兴市上虞英华贸易有限公司）。

2 实验方法

2.1 桑叶药材水分的测定

实验采用《中华人民共和国药典》[15]（2020版）中的水分测定方法测定桑叶样品的含水量，其中规定桑叶中水分含量不得超过15.0%。12种桑叶的水分测定结果见表1。实验结果表明，桑叶样品的水分在5.35%～7.98%之间，平均含水量在6.30%，样品间水分差异不大，各样品含水量均在15%以下。

表1桑叶水分测定结果

桑叶样品编号名称采集时间水分含量/% 1鸡桑2021年10月5.78 2新疆白桑2021年10月5.82 3药桑2021年10月6.85 4华桑2021年10月5.35 5白桑2021年10月6.12

续表1桑叶水分测定结果

桑叶样品编号名称采集时间水分含量/% 6长果桑2021年10月5.89 7山桑2021年10月6.23 8瑞穗桑2021年10月6.86 9垂枝桑2021年10月5.53 10鲁桑2021年10月7.98 11蒙桑2021年10月6.32 12广东桑2021年10月7.21

2.2 桑叶非腺毛的显微特征常数测定定量方法条件优化设计

2.2.1 桑叶显微定量条件优化设计实验

显微定量实验中的影响因素主要有混悬剂用量、样品粉碎粒度以及样品的质量。由于考虑到显微定量方法中的影响因素，本实验采用3因素6水平均匀设计实验对桑叶进行显微特征常数测定，以对实验条件进行优选，从而优化显微定量方法。桑叶药材非腺毛显微定量法的均匀设计方案如表2所示。

表2均匀设计方案U（6）

样品号样品质量/mg粉碎粒度/目加入甘油量/mL 1201004 2401207 3601203 4801006 51001002 61201205

取1号鸡桑样品，粉碎后分别过100目和120目筛。精密称定20 mg、40 mg、60 mg、80 mg、100 mg、120 mg共6份鸡桑样品，分别用水合氯醛多次水飞，之后移入10 mL量瓶中，按照表2各自加入相应的甘油量，用水合氯醛定容。将溶液充分摇匀，精密吸取20μL混悬液制作显微装片，6份样品分别平行制作装片10张，于显微镜下观察非腺毛并计数。将所得结果随机分成5组，分别计算平均值的RSD值，以每份样品平均值的RSD值为考察指标，运用SPSS 26.0软件进行分析，得到均匀设计方案的优化实验结果如表3所示。

表3均匀设计方案U（6）的优化实验结果

样品号样品质量/mg非腺毛的RSD值/% 1208.11 2405.05 3604.15 4809.22 51009.45 61204.91

2.2.2 统计学方法

运用SPSS 26.0统计软件对上述实验结果进行统计学分析，以每组桑叶药材非腺毛数量平均值的RSD值（）为指标，1为样品质量，2为粉碎粒度，3为加入甘油量，得出回归方程为=30.043-0.2112，2=0.934，=71.540，=0.001＜0.05，说明整体上理论回归模型有统计学意义。

根据上述实验结果方程，1与3并没有进入方程，说明1与3对显微特征常数测定的实验结果无影响，即桑叶中非腺毛显微定量的优化条件为样品重量60.00 mg，粉碎粒度为120目，加入甘油量为3 mL。

2.2.3 桑叶非腺毛显微特征常数测定均匀设计验证实验

取1号鸡桑样品，粉碎后过120目筛，精密称定60 mg样品3份，用水合氯醛多次水飞后转入10 mL量瓶中，加入3 mL甘油，用水合氯醛定容至刻度，摇匀后精密吸取20 μL混悬液，平行制片10张，在显微镜下观察非腺毛并计数，将观察统计的实验数据随机化分组，计算平均值的RSD值，实验结果如表4所示。

表4均匀设计验证实验结果

样品号样品质量/mgRSD值/% 160.14.12 260.34.05 360.04.11

根据上述均匀设计验证实验结果，每份样品的RSD值均接近于最小变异系数4.15%，说明由SPSS 26.0统计软件所给出的统计学结果是准确的、科学的。

2.2.4 桑叶非腺毛显微特征常数测定

精密称取12种桑叶粉末，每种桑叶药材称取60.0 mg，各3份，按照2.2.1项下的条件，称取粉末后用水合氯醛多次水飞，并定容至10 mL量瓶中，吸取20μL混悬液，平行制装片10张，于显微镜下观察非腺毛并计数，取非腺毛的平均值后按照如下公式（1）计算桑叶药材中非腺毛显微特征常数（），结果如表5所示。

=（×）/（’×） （1）

上述公式中，为非腺毛显微特征常数值，为每张装片中非腺毛的数量，为桑叶样品混悬液的总体积（mL），’为每张装片的混悬液体积（mL），为桑叶样品质量（mg）。

表5桑叶显微特征常数测定结果

样品编号名称显微特征常数值/个/mg 1鸡桑350 2新疆白桑134.2 3药桑312.6 4华桑96.6 5白桑142.5 6长果桑413.4 7山桑81.0 8瑞穗桑132.3 9垂枝桑415.7 10鲁桑132.3 11蒙桑61.6 12广东桑130.6

由表5可知，12个品种桑叶非腺毛的显微特征常数值具有一定的差异，其中显微特征常数值最大的为垂枝桑415.7个/mg，最小的为蒙桑61.6个/mg。显微特征常数的测定可为后续开展显微特征常数与化学成分含量的相关性研究以及建立完整的质量标准奠定基础。根据相关性分析结果，可在未提取桑叶药材前，对桑叶进行显微特征常数测定，有利于判断桑叶药材质量的优劣，为明确桑叶最佳入药品种奠定基础。

3 讨论

本研究利用显微定量方法测定桑叶药材非腺毛的显微特征常数，以非腺毛作为显微特征结构，具有一定的专属性。本实验建立的显微定量方法有助于更方便、快捷地评价桑叶的质量，对桑叶产品的开发利用具有一定的意义。

进行显微定量实验时，需要对不同品种桑叶样品进行粉碎及过筛，由于过筛的粒度不同，会存在非腺毛结构破碎的情况。因此，在对非腺毛进行观察计数时，取较为完整的非腺毛计为一个单位，结构大于50%的非腺毛也计为一个单位。在进行显微装片时，盖玻片需要将混悬液全部覆盖且不能外溢，以减少误差的产生。

4 结论

本研究通过对桑叶进行显微定量分析，发现同属不同品种桑叶的显微特征常数具有一定的差异。其中最大的是垂枝桑，显微特征常数是415.7个/mg；最小的是蒙桑，显微特征常数是61.6个/mg。本实验方法具有一定科学性、可靠性，因此利用桑叶显微特征常数之间存在的差异，可作为评价不同品种桑叶药材的依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2015:360.

[2]祝之友.桑叶论选[J].中国中医药现代远程教育.2021,19(1):197.

[3]张倩,张立华.桑叶的化学成分及开发利用进展[J].湖北农业科学.2020,59(15):16-19.

[4]杨继华,曹俊明,陈冰,等.桑叶黄酮类化合物提取纯化,生物学功能研究进展[J].广东畜牧兽医科技,2018,43(3):9-15.

[5]CHEN J J,LI X R.Microwave-assisted extraction of flavo-noids in Mulberry leaf and root-bark[J].Zhong Yao Cai.2006,29(10):1090-1092.

[6]WANG H J,ZHAO L,SHEN Y,et al.1-Deoxynojirimycin and its derivatives:A mini review of the literature[J].Current Medicinal Chemistry,2021,28(3):628-643.

[7]MA G Q,CHAI X Y,HOU G G,et al.Phytochemistry,bio-activities and future prospects of mulberry leaves:A review[J].Food Chemistry,2022,372:131335.

[8]HOU Q,QIAN Z,WU P,et al.1-Deoxynojirimycin from mulberry leaves changes gut digestion and microbiota com-position in geese[J].Poultry Science.2020,99(11):5858-5866.

[9]WU S.Mulberry leaf polysaccharides suppress renal fibr-osis[J].International Journal of Biological Macromolecules,2019,124:1090-1093.

[10]SUTHAMWONG P,MINAMI M,OKADA T,et al.Admi-nistration of mulberry leaves maintains pancreatic β-cell m-ass in obese/type 2 diabetes mellitus mouse model[J].BMC Complementary Medicine and Therapies,2020,20(1):136.

[11]LI J S,JI T,SU S L,et al.Mulberry leaves ameliorate di-abetes via regulating metabolic profiling and AGEs/RAGE and p38 MAPK/NF-κB pathway[J].Journal of Ethnopharm-acology,2022,283:114713.

[12]樊柳园,朱华,滕建北,等.显微数量化在中药品质鉴定的应用[J].中华中医药学刊,2019,37(8):1868-1872.

[13]宛冬敏,栾晓静,鞠庆波,等.中药显微定量法的应用研究[J].辽宁中医杂志,2006,33(4):459-460.

[14]王珺,张南平.中药显微鉴别研究与应用进展[J].中国药事,2018,32(8):1051-1057.

[15]国家药典委员会.中国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社,2020:310.

10.3969/j.issn.2095-1205.2022.06.03

S888

A

2095-1205(2022)06-08-03

辽宁省教育厅项目（L201938）

史锐（1979- ），男，汉族，辽宁本溪人，博士研究生，副教授，研究方向为中药质量标准。