西瓜枯萎病尖孢镰孢菌生理小种3 初报

王 冠，李小妮，杨万邦，薛丽芳，张兴平，李建设，邓 云

（1.宁夏大学农学院 银川 750021； 2.北京大学现代农业研究院 山东 潍坊 261000；3.宁夏农林科学院园艺研究所 银川 750002）

西瓜（L.）是一种重要的经济作物，在全世界广泛种植，中国是世界上最大的西瓜生产与消费国。枯萎病是西瓜的主要病害之一，给西瓜生产造成严重损失。尖孢镰孢菌西瓜专化型（f. sp.，FON）是西瓜枯萎病的主要致病菌，存在明显的种内分化，根据其对不同抗病品种的致病力，划分为4 个生理小种，分别是生理小种0、1、2 和3。

宁夏回族自治区是我国著名的压砂西瓜和夏季西瓜产区，由于长期的连作，该地区西瓜枯萎病发病日益严重，然而宁夏地区西瓜枯萎病致病病原菌鉴定未见研究报道。迄今为止，国内报道了4 个生理小种中的3 个，分别为小种0、1 和2，生理小种3 尚未见报道。其中生理小种0 在河北、武汉和安徽被报道。生理小种1 在中国是优势小种，已在河北、湖北、新疆、黑龙江、山东和北京被报道。而生理小种2 仅在河北被报道。Zhou 等首次报道了在美国马里兰州引起PI 296341-FR 枯萎病发病率高于78%的病原菌，并将其鉴定为新的生理小种，即生理小种3。

2021 年笔者在宁夏回族自治区银川市贺兰县金山村金城5 号商品西瓜生产基地观察到典型的枯萎病病株，该品种高抗枯萎病生理小种1。为了明确该病害的病原种类，笔者采集典型发病植株进行病原菌分离纯化，采用形态学和分子生物学方法进行病原菌鉴定，并利用西瓜鉴别寄主接种进行生理小种鉴定，为进一步防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试病样：2021 年7 月从宁夏回族自治区银川市贺兰县金山村商品西瓜生产基地采集具有典型发病症状的西瓜植株。西瓜品种为金城5 号（由中卫市金城种业有限责任公司选育），高抗枯萎病生理小种1。鉴别寄主：Black Diamond、Crimson Sweet、Calhoun Gray 和PI 296341-FR，由国家西甜瓜种质资源中期库友情提供。对照菌株：尖孢镰孢菌西瓜专化型生理小种2（NXWFW011），与供试病样分离自同一地块，经鉴别寄主鉴定为生理小种2。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离纯化 将采集到的发病植株沿茎基部剪下，用清水清洗干净后，将样品置于75%酒精中浸泡30 s，然后用无菌水冲洗3 次，灭菌滤纸吸干表面水分后，从病健交界处切取30 mm的小块组织，接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上26 ℃黑暗培养4 d，选择形态与镰孢菌相似的菌落，将分离菌株单孢纯化后转入PDA 培养基保存备用。

1.2.2 病原菌致病性鉴定 2021 年10—11 月在山东省潍坊市北京大学现代农业研究院作物育种平台采用柯赫氏法则对分离菌株进行致病性验证。采用浸根法接种，将处于子叶展平期的Black Diamond 西瓜苗根系漂洗干净后，在6×10个孢子·mL的孢子悬浮液中浸根30 s，随后采用随机区组方法栽种于32 孔穴盘中，基质经灭菌处理，在人工气候室中培养，温度26°C/22°C（日/夜），光照14 h/10 h（日/夜），相对湿度60%，以清水接种的幼苗作为对照，每个处理接种6 株，3 次重复。接种后的28 d内，持续观察幼苗发病情况以确认分离菌株的致病性。

1.2.3 病原菌形态学鉴定 将纯化好的病原菌接种至PDA 平板上，26 ℃培养7 d，观察菌落形态；在100 倍倒置显微镜下直接观察小型分生孢子的产生方式并拍照。然后依据相关分类方法进行种类鉴定。

1.2.4 病原菌分子生物学鉴定 采用CTAB 法提取 病 原 菌 基 因 组DNA，PCR 扩 增-区 序列。反应体系：DNA 模板1 μL、10 μmol·L上下游引物各2 μL、2×Plus PCR MasterMix（北京瑞博兴科生物技术有限公司）25 μL，加ddHO 至50 μL。扩增条件：94 ℃预变性90 s，92 ℃变性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，共35 个循环，最后72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。PCR 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京擎科生物科技有限公司测序。将得到的序列在NCBI 中进行BLAST 比对，初步明确病原菌种类。

1.2.5 病原菌生理小种鉴定 2021 年11 月中旬至12 月底利用4 个西瓜鉴别寄主Black Diamond、Crimson Sweet、Calhoun Gray 和PI 296341-FR 在北京大学现代农业研究院人工气候室中鉴定病原菌的生理小种。将分离菌株的孢子悬浮液浓度调整至6×10个孢子·mL，用同样的方法接种西瓜鉴别寄主，采用随机区组方法以清水和生理小种2 菌株接种作为对照，每个处理接种12 株，3 次重复，用灭菌基质栽种于32 孔穴盘内。接种后培养条件同上，在接种后的28 d 内持续观察发病情况。根据分离菌株对鉴别寄主的致病反应，鉴定其生理小种。

1.2.6 病情分级标准及数据统计 统计时将西瓜枯萎病划分为7 个等级，0 级：无感染症状；1 级：子叶边缘黄化，生长正常；3 级：子叶枯萎，生长发育变缓；5 级：植株失水，表现出枯萎症状；7 级：整株枯萎死亡，根据发病级数，对鉴别寄主的单株进行表型判断，0～3 级为抗病，5～7 级为感病。植株发病率=（感病株数/调查总株数）×100%，使用Excel 2019 统计感病植株数量并计算发病率，利用SPSS 26 对发病率进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 病害症状

由图1 可以看出，在发病地块，西瓜感病植株呈簇状或“热点”分布，植株枯萎死亡。感病植株根系变成深褐色，根系逐渐坏死，无新生根系，维管束变褐。

图1 西瓜枯萎病田间症状

2.2 病原菌形态特征

由图2 可以看出，经分离纯化后，获得1 个纯化菌株（NXWFW008）。菌株NXWFW008 在PDA培养基上形成圆形菌落，气生菌丝生长旺盛缠绕成束，菌落边缘整齐，气生菌丝呈丝绒状，白色至淡粉色，培养基背面淡粉色；小型分生孢子数量多，椭圆形，卵形或肾形，0～1 隔，以无隔为主，大小为（5.0～10.0）μm×（1.0～3.0）μm；大型分生孢子镰刀型，数量较少，孢子细而弯曲，两端均匀变尖，足胞明显，多为3～5 隔，大小为（20.0～36.0）μm×（3.0～5.0）μm；产孢细胞在气生菌丝上侧生的分生孢子梗上形成，有稀疏分枝，单瓶梗，安瓿瓶形，较短，为典型的尖孢镰孢菌特征。

图2 病原菌镜检

2.3 分离菌株的致病性

由图3 可以看出，接种菌株NXWFW008 导致西瓜感病品种Black Diamond 呈典型的枯萎病症状，接种7 d 后植株表现叶片轻度失水萎蔫，随后症状进一步发展，西瓜整株萎蔫，根及茎基部坏死致整株死亡（图3-b），与田间症状相同（图1-b）。接种清水对照植株没有任何枯萎症状（图3-a）。且从发病植株中重新分离出了接种菌株，菌落形态与NXWFW008 一致，表明分离菌株NXWFW008 是西瓜枯萎病的致病菌。

图3 致病性检测

2.4 EF-1α基因序列分析

菌株NXWFW008 的-基因序列比对分析结果表明，NXWFW008 与Genbank 序列登记号为 MZ773247.1、MZ773246.1、MW505885.1 和MW315889.1 的参考菌株序列同源性均达99.7%，且依据最大似然法（ML）构建的系统发育树也显示，菌株NXWFW008 与上述参考菌株聚为一支，自举支持率为100%，遗传关系近（图4）。因此，鉴定分离菌株NXWFW008 为f.sp.。

图4 基于EF-1α 序列构建的ML 进化树

2.5 病原菌生理小种鉴定

由表1 可以看出，4 个鉴别寄主对不同生理小种的抗感反应，Black Diamond 感所有生理小种，Crimson Sweet 抗生理小种0，Calhoun Gray 抗生理小种0 和1，PI 296341-FR 抗生理小种0、1 和2。

接种菌株NXWFW008 后，PI 296341-FR 发病率高达93.75%，而Black Diamond、Crimson Sweet和Calhoun Gray 完全感病，发病率均为100%，不同鉴别寄主发病率无显著差异（表1，图5），4 个西瓜鉴别寄主均表现为高感病与生理小种3 抗感反应一致。接种菌株NXWFW011 后，Black Diamond、Crimson Sweet 和Calhoun Gray100%发病死亡，而PI 296341-FR 发病率为16.65%，表现为高抗。与NXWFW011（race 2）相比，菌株NXWFW008 能够侵染PI 296341-FR 且发病率高达93.75%，因此鉴定NXWFW008 为生理小种3。

图5 不同菌株和对照接种后4 个西瓜鉴别寄主发病情况

表1 鉴别寄主对不同生理小种的抗性及寄主对菌株NXWFW008 的鉴定结果

3 讨论与结论

菌株NXWFW008 的形态学、分子生物学和鉴别寄主鉴定结果表明，分离自宁夏回族自治区银川市贺兰县金山村的西瓜枯萎病致病菌为尖孢镰孢菌西瓜专化型生理小种3（f.sp.，race 3）。张兴平利用不同抗性的西瓜品种，对国内8 个省市的西瓜枯萎病菌分离物进行鉴定，首次证明了我国存在西瓜枯萎病生理小种分化，此后国内陆续报道了生理小种0、1 和2，优势致病菌为生理小种1。生理小种3 在全球分布较少，目前仅在美国马里兰州、佛罗里达州和乔治亚州被报道，本研究为尖孢镰孢菌生理小种3 侵染导致的西瓜枯萎病在中国的首次研究报道。

生理小种3 在宁夏地区的出现，可能是由长期种植抗生理小种1 的品种对病原菌形成的高选择压力造成的。金山村商品西瓜生产基地已经连续种植超过25 年，瓜农均选择种植抗生理小种1的栽培品种，包括金城5 号、冠龙、瑞龙等，主栽品种为金城5 号，有研究显示金城5 号对枯萎病生理小种2 也有较强的抗性，长期种植抗病品种会对病原菌造成额外的选择压力，使病原菌向致病力更强的方向进化，生理小种2（NXWFW011）和生理小种3（NXWFW008）在同一地块中被发现，为生理小种3 由生理小种2 进化而来提供了额外的证据。

生理小种3 的存在对宁夏地区的西瓜生产构成了新的威胁，增加了西瓜枯萎病防治的难度，目前还未见抗生理小种3 西瓜种质的报道，长期轮作和化学熏蒸被认为是防治由生理小种3 引起的西瓜枯萎病的最佳选择。宁夏其他地区以及全国西瓜主产区枯萎病优势致病菌是否发生演变，急需开展全面的鉴定，以制定相应的防控措施来保障西瓜产业健康发展。