聚乙烯微塑料对花生幼苗镉吸收及生理特征的影响

宗海英，刘君，郭晓红，李萌，黄小丽，王芳丽，宋宁宁*

（1.青岛农业大学资源与环境学院，山东 青岛 266109；2.鲁东大学资源与环境工程学院，山东 烟台 264025；3.山东省蚕业研究所，山东 烟台 264001；4.青岛农业大学中心实验室，山东 青岛 266109）

微塑料（Microplastics，MPs，指颗粒尺寸＜5 mm的塑料）作为一种新型污染物成为当前国际环境科学研究的热点之一。关于海洋生态系统中的MPs污染已被大量报道。近期研究显示，陆地环境中的MPs丰度可能是海洋中的4～23倍，尤其是农田土壤中，发现大量MPs的存在。据调查，山东省沿海地区土壤MPs丰度为1.3～14 712.5个·kg。武汉某郊区蔬菜农田中MPs的平均丰度为320～12 560个·kg。同时，在云南省10个县100个地点采集的土壤样品均存在严重的MPs污染，进一步研究发现，这些MPs污染均与地膜的使用有关。另外。在全国19个省份采集的384份土壤样品中也得到了类似的结果，即地膜使用量与土壤MPs之间呈线性正相关关系。农用薄膜主要成分为聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯，它们在自然状态下难以降解，且使用过的旧残膜不易回收利用，导致薄膜经自然风化破碎成MPs残留在土壤环境中。

MPs进入土壤后会影响土壤理化性质、改变土壤生物活动、破坏土壤生态系统，进而影响植物生长发育。例如，廖苑辰等研究表明，高浓度（200 mg·L）的聚乙烯微塑料会显著抑制小麦根系生长和降低小麦的叶绿素含量。LI等研究表明，黄瓜水培溶液中添加50 mg·L的100 nm聚苯乙烯纳米塑料7 d和14 d后，在黄瓜各干组织中检测到0～6 893µg·g纳米塑料。MPs不仅会抑制作物生长，降低作物产量，还会造成蔬菜品质下降。因此，MPs的存在对农业生态系统构成了极大的威胁。

我国土壤环境中除了MPs污染外，还存在持久性有机污染物和重金属等污染物。2020年全国生态环境质量简况报告显示，重金属是影响农用地土壤环境质量的主要污染物，其中Cd是主要的重金属污染物。土壤中的Cd具有较强的移动性，易被植物根部吸收并运输到可食用部位，对人体健康构成威胁。MPs粒径小，具有较高的比表面积，极易与其共存的重金属Cd产生潜在的相互作用，进而影响作物的生长和发育。但是目前关于MPs和重金属相互作用对作物毒性的研究多关注于Cd积累的研究，而对作物生理特征的研究相对较少。

花生是我国重要的油料作物，普遍采用覆膜栽培。同时，花生也极易吸收土壤中的Cd。种植花生的土壤中不可避免地同时存在MPs和Cd污染。因此，本研究以花生为供试植物，以聚乙烯微塑料（PE）和Cd为研究对象，研究单一PE或与Cd复合污染对花生生理特性及吸收Cd的影响，进一步探讨PE和Cd复合污染对作物的毒性效应，为MPs和重金属复合污染环境风险评价及污染治理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花生品种为鲁花8号，由山东省花生研究所提供。PE购于河北弘耀实业有限公司，颗粒密度为0.940～0.976 g·cm，粒径为100～500µm。

1.2 试验设计

选取饱满且大小一致的花生种子，用1%的次氯酸钠灭菌10 min，自来水冲洗干净后用蒸馏水浸泡24 h，7 d后选取长势均一的花生幼苗，移入装有Hoagland（pH 5.8）半营养液的塑料盆中进行培养（每盆含有5颗幼苗），4 d后加入Hoagland全营养液，花生幼苗生长10 d后，设置PE和Cd单一和复合试验。参考廖苑辰等研究中的MPs浓度，同时结合本研究前期预实验，PE添加浓度分别为0、50、200 mg·L（分别标记为PE0、PE50、PE200）；根据课题组前期Cd胁迫对花生生理特征的研究，Cd暴露浓度为0、25、100µmoL·L（分别标记为Cd0、Cd25、Cd100）。每个处理设置三次重复，随机区组设计。全营养液每隔3 d更换一次，处理41 d后收获植株并测定相关指标。培养条件：光照14 h，光强为800 µmol·m·s，温度为白天25±1℃、夜晚22±1℃，湿度为60%±5%。

1.3 指标测定方法

1.3.1 花生生长指标测定

新鲜花生样品在105℃下杀青30 min，然后在75℃下烘干至恒质量，分别测定地上部和根部干质量。

1.3.2 根系活力测定

根系活力采用TTC法测定：花生收获后，每个处理组随机选取0.5 g根尖样品，经TTC处理后，于485 nm下进行比色并计算根系活力。

1.3.3 植株Cd含量测定

显效:术中无疼痛等不适,无出现血压降低、认知功能障碍等并发症,心率、动脉压麻醉前后稳定;有效:术中轻度疼痛不适,心率、动脉压麻醉前后有一定波动;无效:术中明显疼痛,出现并发症,心率、动脉压麻醉前后明显波动。老年腹腔镜全麻手术麻醉效果为显效、有效百分率之和[2]。

地上部和根部样品烘干，研磨，经硝酸-高氯酸（4∶1）消解后，采用原子吸收分光光度计测定Cd含量。

1.3.4 丙二醛含量测定

丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定。

1.3.5 抗氧化酶测定

新鲜花生叶片或根系低温下研磨成匀浆，经离心提取后，分别采用蓝四唑（NBT）光化还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）、愈创木酚比色法测定过氧化物酶（POD）、紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）。

1.4 数据分析

采用Excel 2019对试验结果进行处理，图中数据均以平均值±标准差表示。运用SPSS 19.0对数据进行方差分析和双因素分析，使用Duncan法对各处理进行多重比较（＜0.05）。运用Origin 2018进行制图。

2 结果与讨论

2.1 PE和Cd复合污染对花生幼苗生长的影响

由图1可知，MPs单一处理时，与PE0相比，PE50显著增加了花生地上部和根部生物量，增加幅度分别为9.23%和12.6%；而PE200与PE0差异不显著。说明在没有Cd胁迫条件下，低浓度PE对花生生长具有一定的促进作用。PE与Cd交互作用时，在Cd25条件下，与PE0相比，PE50和PE200减少花生地上部生物量的幅度分别为6.45%和15.4%。在Cd100时，PE50和PE200处理花生地上部生物量分别降低17.4%和46.4%。MPs单一及其与Cd复合污染对花生根部的影响与对地上部影响的规律一致，即PE单一处理时，低浓度PE（50 mg·L）促进了花生根部的生长，增加了花生根部的生物量，而高浓度PE（200 mg·L）对花生根部生物量无显著影响。在Cd存在条件下，PE50和PE200均显著抑制了花生根部的生长，且随着PE浓度升高抑制作用增强。双因素分析表明，PE和Cd共存对花生地上部和根部生长的影响显著（表1），说明PE和Cd交互对花生生长的抑制作用具有协同效应。

表1 PE和Cd的交互作用Table 1 The interaction between PE and Cd

图1 PE和Cd复合污染对花生幼苗生物量的影响Figure 1 Effects of the combination of PE and Cd on peanut biomass

2.2 PE和Cd复合污染对花生幼苗MDA含量的影响

MDA是植物细胞膜中不饱和脂肪酸产生过氧化反应的产物。一般植物体内MDA含量越高，说明植物细胞膜氧化损伤越严重。从图2可以看出，PE单一及其与Cd复合污染均导致花生地上部和根部MDA含量上升。就花生地上部MDA而言，PE单一处理时，与未添加PE相比，PE50处理对花生地上部MDA含量无显著影响，而PE200处理显著增加了地上部MDA含量，增加幅度为23.5%。说明高浓度（200 mg·L）的PE会导致植物地上部细胞膜的氧化损伤。可能原因是累积在植物根部的PE，通过细胞壁和细胞间隙进入植物脉管系统，通过脉管系统转移到植物地上部，导致PE对植物茎和叶产生损害，并引起细胞膜的氧化损伤。而较低浓度PE导致的氧化损害作用，会通过植物自身抗氧化系统进行调节而缓解。

图2 PE和Cd复合污染对花生幼苗MDA含量的影响Figure 2 Effects of the combination of PE and Cd on peanut MDA content

PE和Cd共存使得花生地上部MDA含量显著增加（图2）。其中，Cd25条件下，与PE0相比，PE50和PE200处理使花生植株内MDA分别提高8.13%和12.4%。Cd100时，与未添加PE相比，仅PE200显著提高了花生地上部MDA含量。PE和Cd交互作用下根部MDA含量的变化与地上部有所不同。例如在Cd100时，PE50和PE200均显著提高了根部MDA含量，增幅分别为18.1%和45.7%。以上结果说明PE会加重Cd对植物的氧化损伤。与单一PE相比，PE和Cd交互作用也显著提高了花生地上部和根部MDA含量，且随着PE和Cd浓度升高，提高幅度增强。通过双因素分析也发现Cd对花生幼苗MDA含量的影响显著，PE和Cd交互也显著影响了花生幼苗MDA的含量，可见PE和Cd共存对植物的氧化胁迫表现出协同作用。原因可能是高浓度PE会吸附、运载大量Cd到花生体内，造成Cd在花生体内的大量积累。有研究证实Cd在植物体内会破坏细胞膜结构，引起植物活性氧增加，加剧植物细胞膜氧化损伤。

2.3 PE和Cd复合污染对花生幼苗抗氧化酶的影响

SOD、POD和CAT是生物适应和抵抗逆境胁迫的重要酶，也是清除活性氧的关键酶，被称为抗氧化酶。由图3可以看出，PE单一及与Cd复合污染均会对花生地上部和根部抗氧化酶产生影响。就花生地上部而言，PE单一处理时，与PE0相比，PE50对花生地上部SOD、POD和CAT活性无显著影响，而PE200显著提高了三类抗氧化酶的活性。说明高浓度（200 mg·L）PE胁迫条件下，花生会通过提高地上部氧化酶活性来中和活性氧，使植株细胞免受PE的毒害。刘玲等在研究MPs对水稻SOD、POD和CAT活性时也发现同样的结果，即10 mg·LMPs（100 nm）会增加水稻抗氧化酶的活性。但廖苑辰等的研究发现，随着土壤苯乙烯MPs（5 µm）含量的增加（0～100 mg·kg），小麦SOD活性一直下降，而CAT活性先下降后上升。这与本研究结果不太一致，这可能是由于MPs材料、浓度和粒径不同所引起的。

图3 PE和Cd复合污染对花生幼苗SOD（A）、POD（B）和CAT（C）活性的影响Figure 3 Effects of the combination of PE and Cd on the peanut activities of SOD（A）,POD（B）and CAT（C）

PE和Cd复合污染条件时，在Cd25条件下，PE50对花生地上部SOD和CAT无显著作用（＞0.05），却显著提高了POD的活性，增幅为53.5%。PE200均显著提高了SOD、POD和CAT的活性，增幅分别为14.9%、83.5%和60.0%。Cd100时，PE50和PE200均显著提高了三类抗氧化酶的活性。PE和Cd复合污染时，花生根部SOD和CAT酶活性变化与地上部的规律基本一致，而POD活性变化与地上部有所不同，即在Cd暴露条件下，PE50和PE200处理之间根部POD活性差异显著。SOD是植物防御氧化胁迫的第一道防线，能把活性氧中的O·转化为HO，随后CAT和POD清除HO。SOD、CAT和POD通过协同作用使植物体内的活性氧处于平衡状态，防止植物细胞免受损害。酶活性的短暂变化是植物体自身为免受外部环境胁迫而产生的调节反应。通过双因素分析发现，PE和Cd共存对SOD、POD和CAT活性的升高表现出协同作用（表2），说明花生通过改变以上3种酶的活性来中和产生的活性氧，使机体免受PE和Cd的毒害。MENG等探究Cd胁迫对蔬菜抗氧化酶活性的影响时也发现，菠菜和生菜会通过增高酶活性来使自身免受环境胁迫的影响。

2.4 PE和Cd复合污染对花生幼苗根系活力的影响

根系活力是指根系吸收和合成营养成分以及氧化还原的能力。植物受到Cd毒害后首先影响到根系的生长发育，从图4可以看出，在未添加Cd的处理中，PE50可以显著提高花生的根系活力，增幅为8.03%，可见低浓度（50 mg·L）PE会促进根系活力。PE和Cd复合污染时，Cd25条件下，与PE0相比，PE50和PE200对花生的根系活力表现出显著的抑制作用，使得根系活力分别降低10.8%和22.7%。Cd100时，PE50和PE200对根系活力的抑制作用增强。与单一PE相比，PE和Cd交互显著降低了花生的根系活力，PE和Cd100交互时的花生根系活力显著低于PE和Cd25交互时的根系活力，说明PE和Cd对根系活力的抑制作用具有协同效应。本研究结果与DONG等的PE和As复合胁迫加剧了对水稻根系活力的毒性作用的结果基本一致。这可能是因为PE在根系的累积，堵塞根部通道，扰乱了水分和养分的运输，引起根系细胞内产生过量的活性氧，导致防御系统平衡被打破引发了更高的毒性。因为据KALCIKOVÁ等的研究发现，液配条件下，聚乙烯微珠会大量附着于浮萍根系表面，干扰浮萍对养分和水分的吸收。

图4 PE和Cd复合污染对花生幼苗根系活力的影响Figure 4 Effects of the combination of PE and Cd on peanut root activity

2.5 PE和Cd复合污染对花生幼苗Cd含量的影响

PE和Cd复合作用也促进了花生对Cd的积累，且随着PE浓度增加，促进作用逐渐增强（图5）。就花生地上部而言，在Cd25的处理中，与PE0相比，PE50和PE200显著提高了花生地上部对Cd的吸收，增幅分别为35.5%和60.9%，且PE50和PE200处理之间差异显著。Cd100处理时，PE50和PE200使得花生地上部Cd吸收增加幅度分别为40.9%和78.8%，且PE50和PE200处理之间差异显著。PE和Cd复合污染对根部吸收Cd的影响与地上部规律一致，即添加PE促进了根部对Cd的吸收，且随着PE浓度的增加根部Cd浓度也随之增加。通过双因素分析也发现，PE和Cd交互对花生地上部和根部Cd浓度具有显著影响（表2）。以上结果说明，PE和Cd交互会促进花生对Cd的吸收。WANG等研究了土壤中MPs和Cd复合污染对生菜Cd积累的影响，指出MPs可通过改变土壤理化性质提高生菜对Cd的吸收。而本研究条件为液配试验，不存在改变土壤理化性质的现象。CAO等报告指出在液配条件下MPs与其共存的重金属会通过静电力和非共价发生复杂的相互作用，进而影响重金属离子的有效性。例如刘玲等研究MPs和Pb复合胁迫对水稻根系Pb含量影响时发现，10 mg·L和20 mg·L聚苯乙烯MPs可抑制水稻根系对Pb的吸收，而更高浓度（40 mg·L）聚苯乙烯微塑料MPs促进了Pb在水稻根系中的积累。解释原因是低浓度MPs与Pb存在竞争吸附，导致根系降低了对Pb的吸收，而高浓度的MPs会作为载体将Pb转移到水稻体内，造成水稻根系内Pb的积累。推测本研究PE增强花生对Cd的积累机制可能与PE对Cd的吸附和载体效应有关。但具体机制有待进一步研究。

图5 PE和Cd复合污染对花生幼苗Cd浓度的影响Figure 5 Effects of the combination of PE and Cd on Cd concentration of peanut

3 结论

（1）聚乙烯微塑料（PE）单一处理时，低浓度（50 mg·L）PE可显著提高花生的生物量。高浓度（200 mg·L）PE提高了花生体内丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性，并抑制了根系活力，降低了花生生物量。

（2）PE和Cd复合污染条件下，无论是低浓度Cd（25 µmol·L）污染还是高浓度Cd（100 µmol·L）污染，添加PE均显著提高了花生MDA含量，抗氧化酶活性和Cd吸收，抑制了花生根系活性和生长，且随着PE添加量的增加，其作用程度增强，说明微塑料会加剧Cd对植物的毒性。

（3）双因素分析表明，PE和Cd交互时对花生生长、MDA含量、抗氧化酶活性和Cd吸收均表现出显著影响，表明PE和Cd共存对花生幼苗生理毒性和Cd吸收表现出协同作用，实际农业生产中应加强对地膜源微塑料和重金属污染的管控。