基于生物信息学构建卵巢浆液性腺癌预后风险模型 及潜在中药预测分析

盛超，金芳和

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208 2 湖南中医药大学附属常德医院 湖南常德 415000

根据卵巢恶性肿瘤诊断与治疗指南（2021年版）指出[1]，卵巢癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤之一，发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中位居第3 位，病死率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢癌以上皮性肿瘤最为常见，占90%以上。占5%~6%，生殖细胞肿瘤占2%~3%[2]。在上皮性卵巢癌中，高级别浆液性癌（high grade serous carcinoma，HGSC）占70%，子宫内膜样癌占10%，透明细胞癌占10%，黏液性癌占3%，低级别浆液性癌（low grade serous carcinoma，LGSC）＜5%[3]。其中在卵巢浆液性腺癌（Ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）中，高级别浆液性癌与低级别浆液性癌均为恶性肿瘤[1]。而对于上皮性卵巢癌的化疗，卡铂-紫杉醇联合化疗仍然是一线化疗的首选方 案[4]。然而，由于耐药性强，大多数患者最终复发，特别是对于铂类药物[5]。因此，药物的选择对于OV 靶点的干预显得尤为重要。

本研究采用生物信息学方法，以OV 核心差异预后基因为落脚点，构建OV 预后风险评分系统，开发有效的临床预后预测模型，分析预后基因的免疫浸润情况，望筛选出临床有效治疗OV 的潜在中药，为中医药干预卵巢癌提供了新思路。

资料与方法

1 卵巢浆液性腺癌差异预后基因的获取

通过癌症基因组图谱TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）数据库，下载卵巢浆液性腺癌RNAseq 及其对应临床信息数据。

采 用R 语 言DESeq2 包[6]，以 |log2（FC）|＞1.0、p.adj＜0.05 为筛选条件，对卵巢浆液性腺癌转录组数据进行差异分析，获取卵巢浆液性腺癌差异基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）。

采用R 语言survminer、survival 包，以卵巢浆液性腺癌患者的总体生存期（Overall Survival，OS）及生存时间为结局变量，通过单因素Cox 回归分析，以P＜0.05 为筛选条件，获取卵巢浆液性腺癌预后分子[7]。

通 过Bioinformatics（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/beg）数据库，取卵巢浆液性腺癌差异基因及预后分子的交集，绘制韦恩图，获取卵巢浆液性腺癌差异预后基因。

2 卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因的获取及表达相关性分析

采用R 语言survminer 包[7]构建卵巢浆液性腺癌差异预后基因的Kaplan-Meier（KM）生存曲线，以卵巢浆液性腺癌差异预后基因表达的中位值为临界值，将卵巢浆液性腺癌患者分为高、低表达组，绘制生存曲线，评判高、低表达在卵巢浆液性腺癌中的生存预后价值，以P＜0.05 为筛选条件，聚焦卵巢浆液性腺癌差异预后基因。

通 过TCGA、GTEx（https：//commonfund.nih.gov/GTEx/）数据库[8]，采用R 语言 pROC 包、ggplot2 包绘制受试者工作特征曲线（Receiver Operating Characteristic curve，ROC），以AUC＞0.7 为筛选条件，聚焦卵巢浆液性腺癌差异预后基因。同时满足KM 生存曲线P＜0.05，且AUC＞0.7 的卵巢浆液性腺癌差异预后基因纳入为核心差异预后基因。

为进一步研究核心差异预后基因在卵巢浆液性腺癌患者中的表达及其相关性，对TCGA 数据集中卵巢浆液性腺癌样本数据进行非配对样本t 检验及Spearman 相关性分析，并采用R 语言ggplot2 包绘制箱式图、相关性热图及弦图。

3 卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因风险评分系统构建及临床预测模型开发

采用R 语言survival 包，对卵巢浆液性腺癌样本中7 个核心差异预后基因表达数据与临床信息OS 及生存时间，进行单因素及多因素Cox 回归分析，计算风险评分（Riskscore）。风险评分为各核心差异预后基因表达量与其对应多因素Cox 回归系数的乘积之和。以风险评分的中位数为截断值，将TCGA 数据集中379 例卵巢浆液性腺癌样本分为高、低风险组。采用KM 生存曲线与时间依赖性ROC 曲线对风险评分系统进行生存预后分析，并评估其1年、3年、5年生存预后。

纳入卵巢浆液性腺癌患者的临床信息与风险评分，包括FIGO 分期、疗效评价、年龄、Grade 分级、解剖肿瘤分部、静脉入侵、淋巴入侵、肿瘤残留、肿瘤状态、肿瘤有无情况，进行单因素及多因素Cox 回归分析，将单因素Cox 分析得到的P＜0.1 的自变量进一步纳入多因素Cox 回归模型，筛选卵巢浆液性腺癌的独立预后因子。采用R 语言rms 包构建独立预后因子的临床预测模型诺莫图，并分子总体评分的1年、3年、5年生存概率分析。最后采用Calibration 分析与决策曲线分析（Decision Curve Analysis，DCA）对卵巢浆液性腺癌临床预测模诺莫图进行评价。

4 卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因的免疫浸润相关性分析

通过TCGA 数据库，以P＜0.05 为筛选条件，采用CIBERSORT 反卷积法筛选卵巢浆液性腺癌样本数据，分析卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因与各免疫细胞间的 Spearman 相关系数[9-10]，采用R 语言ggplot2 包绘制卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因与免疫浸润中免疫细胞的相关性热图。

5 卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因的潜在中药预测

通 过Coremine（https：//www.coremine.com/medical/）、TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）、TCMIP（http：//www.tcmip.cn/）数据库，以P＜0.05 筛选条件，反向筛选卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因潜在中药。

结果

1 卵巢浆液性腺癌差异预后基因的获取

采用R 语言DESeq2 包，获取卵巢浆液性腺癌346 个DEGs，其 中270 个 高 表 达，76 个 低 表 达（图1A）；采用survminer、surcival 包单因素cox 回归，获取1645 个预后分子。取差异基因及预后分子的交集，获得14 个卵巢浆液性腺癌差异预后基因（图1B、表1）

表1 卵巢浆液性腺癌差异预后基因描述及主要功能

图1 卵巢浆液性腺癌差异预后基因火山图及韦恩图

2 卵巢浆液性腺癌差异核心预后基因及其表达相关性分析

以P＜0.05 且AUC＞0.7 为筛选条件，采用KM 生存曲线与ROC 曲线，分析卵巢浆液性腺癌差异预后基因的生存预后，发现C20orf204 与卵巢浆液性腺癌患者生存预后不显著（P＞0.05），MCCD1、KRT4、TEX37、FO681492.1、ERVMER34-1、BLK 的ROC 诊断效价较低（AUC＜0.7），AUG 值依次为：0.699、0.619、0.618、0.553、0.497、0.479。最终纳入SAA2-SAA4、FGF20、ADGRG5、EPB41L1、TRPM3、DAP1、KLK3 共7 个卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因，其中SAA2-SAA4、ADGRG5、EPB41L1、DAP1 在卵巢浆液性腺癌中显著高表达（P＜0.001），FGF20、TRPM3、KLK3 在卵巢浆液性腺癌中显著低表达（P＜0.001）（图2A）。

进一步表达相关性研究发现（图2B、图2C），SAA2-SAA4 与DAPL1 正 相 关 性 最 强（cor=0.18），与KLK3 负 相 关 性 最 强（cor=-0.06）。FGF20 与TRPM3 正相关最强（cor=0.24），与DAPL1 负相关性最 强（cor=-0.05）。ADGRG5 与EPB41L1 正 相 关 最强（cor=0.14），与KLK3 负相关性最强（cor=-0.09）。EPB41L1 与KLK3 正相关最强（cor=0.16），与TRPM3负相关性最强（cor=-0.01）。TRPM3 与FGF20 正相关最强（cor=0.24），与SAA2-SAA4 负相关性最强（cor=-0.08）。DAPL1 与SAA2-SAA4 正相关最强（cor=0.18），与KLK3 负相关性最强（cor=-0.12）。KLK3 与EPB41L1 正相关最强（cor=0.16），与DAPL1 负相关性最强（cor=-0.12）。

图2 卵巢浆液性腺癌差异核心预后基因表达差异及分子间相关性

3 卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因风险评分系统构建及临床预测模型开发

对卵巢浆液性腺癌样本中7 个核心差异预后基因多因素Cox 回归分析发现（图3A），SAA2-SAA4、ADGRG5、TRPM3、DAPL1（P＜0.05）均可作为卵巢浆液性腺癌的独立预后基因。KM 生存曲线（图3B）与时间依赖性ROC 曲线（图3C）发现，7 个核心差异预后基因构建的风险评分系统能显著区分生存，低风险评分具有的生存预后（P＜0.001），风险评分的HR=2.03＞1（95%CI，1.55-2.64），是卵巢浆液性腺癌的 危 险 因 素；time-ROC 的1年、3年、5年AUC 面 积分别为0.629、0.622、0.684，提示风险评分能较好的评估生存预后，且5年的预测能力最佳。

对纳入卵巢浆液性腺癌患者的临床信息与风险评分进行单因素、多因素Cox 回归分析（图3D、E），发现FIGO 分期、年龄、肿瘤状态、肿瘤有无、风险评分是卵巢浆液性腺癌患者的预后因素，进一步多因素Cox回归分析发现肿瘤有无与风险评分是卵巢浆液性腺癌患者的独立预后因子。纳入肿瘤有无与风险因子，构建临床预测模型诺莫图，以预测1年、3年、5年的生存概率（图3F）。Calibration 预后（图3G）与DCA（图3H）分析发现，卵巢浆液性腺癌临床预测模型诺莫图具有较好的预测效能，DCA 亚型分析发现肿瘤有无与风险评分联合评价生存预后具有更好的效能。

图3 卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因风险评分系统构建及临床预测模型开发

4 卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因的免疫浸润结果

卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因与免疫浸润细胞的相关性热图表明（图4），SAA2-SAA4 分子与Neutrophils 细胞呈现出最强的正相关性（cor=0.367）、与NK cells 细胞呈现出最强的负相关性（cor=-0.098）；FGF20 与Tcm 细胞呈现出较强的最相关性（cor=0.118）、与Treg 细胞呈现出最强的负相关性（cor=-0.100）；ADFRG5 与B 细胞呈现出最强的正相关性（cor=0.494）；EPB4L1 与Th17 细胞呈现出最强的正相关性（cor=0.205）、与Th2 cells 呈现出最强的负相关性（cor=-0.285）。TRPM3 与NK 细胞呈现出最强的正相关性（cor=0.220）、与Th17 cells 呈现出最强的负相关性（cor=-0.094）；DAPL1 与Th17 cells 细胞呈现出最强的正相关性（cor= 0.119）、与NK 细胞呈现出最强的负相关性（cor=-0.263）；KLK3 与NK 细胞呈现出最强的正相关性（cor=0.218）、与 Cytotoxic cells 细胞呈现出最强的负相关性（cor=-0.216）。

图4 卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因与免疫浸润细胞相关性热图

5 卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因的潜在中药预测结果

Coremine 数据库预测出FGF20 等4 个卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因的卵巢浆液性腺癌潜在中药共18 个，其中，FGF20、EPB41L1 均与一味中药相关（地榆、水蛭），DAPL1 与7 味中药相关（三七叶等），KLK3 与9 味中药相关（蟛蜞菊等），且地榆、三七叶、三七花度值较高，提示其与卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因的关系更为密切（图5A）。

卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因归经数量从大到小依次为：KLK3＞DAPL1＞FGF20＞EPB41L1，药物多归于肝经（图5B），功效多与补虚止血相关（图5C）。其中，整合Coremine 数据库、TCMSP 数据库、TCMIP数据库发现，尚未有报道显示能结合SAA2-SAA4、ADGRG5 TRPM3 此3 个卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因的有效组分/中药。

图5 卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因潜在中药网络图

讨论

肿瘤的发生发展、损伤修复、死亡与增殖是一个连续的过程，是基因、炎症及miRNA 改变等综合因素作用的结果[11-12]。而卵巢浆液性腺癌作为最常见的卵巢癌，发展迅速，极易出现盆腹腔播散和腹膜后淋巴结转移[13]。卵巢浆液性腺癌的发生、发展是一个是多因素、多步骤、多阶段和多基因改变的结果，其中包括抑癌基因的失活与激活，这两种改变可使细胞生长和分化的调节失控，进一步导致基因突变和细胞异常增殖[14]。因为缺乏特异性症状和缺乏有效的早期诊断方法，大多数卵巢浆液性腺癌患者在晚期才被诊断出来，这导致了此类患者预后不良[15]。卵巢浆液性腺癌的发病率呈上升趋势，化疗作为治疗卵巢浆液性腺癌的主要手段，而长期化疗常常使卵巢浆液性腺癌患者的精神处于焦虑的状态，因此，有效的治疗方法成为高发病率、高转移率的卵巢浆液性腺癌患者的迫切需要[16]。

本研究以TCGA 数据库临床信息为源，对OV 进行差异分析与预后分子的筛选，发现OV 有342 个DEGs，其中270 个DEGs 高表达，72 个DEGs 低表达，OV 存在1645 个预后分子。通过将得出的14 个OV差异预后基因构建 KM 生存曲线与ROC 曲线，最终得到SAA2-SAA4、FGF20、ADGRG5 等7 个OV 核心差异预后基因，提示其可作为干预OV 的分子。KM 生存曲线、时间ROC 曲线揭示了OV 低风险组患者预后较好，且对5年OV 患者的预测最为准确。通过多因素Cox 回归分析，构建了卵巢浆液性腺癌的风险评分系统，明确风险评分可以作为独立预后危险因子，低风险评分具有良好的生存预后。同时以风险评分为基础，开发了卵巢浆液性腺癌的临床预测模型诺莫图，并对其进行评价，对1年、3年、5年的生存预后具有较好的预测效能，可进行临床推广。免疫浸润结果构建了7 个卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因与24种免疫细胞的相关性，并计算了靶基因与免疫细胞的相关性系数。Coremine 数据库预测出18 个OV 潜在中药，药物多归于肝经，功效多与补虚止血相关，为中医药干预OV 提供了理论依据。

已有研究指出，SAA2-SAA4 与透明细胞肾癌（ccRC）的发生有关[17]。FGF20 可抑制肿瘤血管的生成和生长[18]。Abanoub A.Gad 指出，ADGRG5 的表达下调可延缓乳腺癌细胞粘附。研究表明，EPB41L5与多形性胶质母细胞瘤、结直肠癌、肾透明细胞癌等肿瘤疾病的发生发展及转移有关[19-21]。陈利侠指出，TRPM3 可通过Wnt/β-catenin 信号通路诱导上皮性卵巢癌细胞上皮间质转化[22]。 DAPL1 通过细胞生长、衰老和细胞凋亡等过程影响卵巢颗粒细胞的寿命，与卵巢颗粒细胞的发生、生长、分化有关[19，23]。 DAPL1也可通过低甲基化影响肺癌患者的预后[24]。 KLK3可通过抑制血管生成起到促进肿瘤生长与转移扩散的 作 用[25]。因 此，SAA2-SAA4、FGF20、ADGRG5、EPB41L5、TRPM3、DAPL1、KLK3 均可作为与肿瘤发生发展相关的靶点。

中医认为，卵巢浆液性腺癌可归于“石瘕”“癥瘕”等范畴。《金匮要略》揭示了瘀血、水湿留滞，积久成癥是形成卵巢癌的主要原因[26]。卵巢癌的总体病机为本虚标实，正虚为本，邪实为标，正气亏虚，六淫邪气乘虚入侵，与气血相搏，导致气血失调，瘀血内停，集于胞络之中，日久痰、瘀、毒邪滞留成癌[27]。瘀血既是致病因素，又是病理产物[26]。活血化瘀是临床治疗肿瘤的常用方法，该方法对恶性肿瘤有抑制转移作用，且不良反应较少，还可增强化疗药物的疗效[28]。因此，活血化瘀疗法可作为治疗卵巢癌的基本治法。三七叶作为化瘀止血药，其中的有效成分三七素具有止血之功、人参皂苷Rg1 兼活血之效，在止血的同时又可活血而不留瘀[29]。三七叶可通过抑制肿瘤细胞诱导的血小板聚集从而起到抑制肿瘤生长、转移的作用[30]。三七花清热解毒以抑菌抗癌。地榆中的地榆皂苷具有低毒性、高脂溶性以及抗肿瘤活性强等优点，可通过增强细胞凋亡蛋白caspase-3 和caspase-9的活性、抑制VEGF 的表达等，也可通过直接杀死肿瘤细胞、诱导细胞凋亡、调节细胞周期和抑制肿瘤转移，最终导致肿瘤细胞凋亡或坏死[31]。吴晓晴[32]通过对益气活血解毒方（生黄芪30g、枸杞子15g、炒白术15g、山药15g、三棱6g、莪术9g、女贞子15g、海藻15g、青皮9g、乌药9g、肉桂6g、青蒿12g、白花蛇舌草15g）治疗铂耐药卵巢癌疗效，和对巨噬细胞表型的影响研究，显示其可延长晚期铂耐药卵巢癌患者的PFS，能降低外周血中IL-6 水平，缓解免疫抑制。李航等[33]发现对复方丹参滴丸（丹参、三七为主要提取物）能够有效的抑制住肿瘤组织内的VEGF 水平，诱导肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤的细胞的增长和迁徙。因此，三七叶、三七花、地榆可作为临床干预卵巢浆液性腺癌的中药。

本研究基于生物信息学多种数据库，构建卵巢浆液性腺癌风险评分系统及临床预测模型，通过筛选卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因，并对卵巢浆液性腺癌核心差异预后基因进行免疫浸润的分析、潜在中药的预测，为中医药干预妇科肿瘤提供了可行性思路。