α-半乳糖苷酶A基因敲除猪胎儿成纤维细胞系的建立

冷允俊，刘晓蕊，李琳，王盈，杨海元，戴一凡

（南京医科大学江苏省异种移植重点实验室，南京 211166）

Fabry病，又称弥漫性血管角质瘤，是一种X连锁隐性遗传的溶酶体贮积病，致病基因为α-半乳糖苷酶A（α-galactosidase A，GLA）基因，位于Xq22.1，由7个外显子和6个内含子构成［1］。GLA基因编码α-Gal A，该酶位于溶酶体内，是一种同源二聚体蛋白，为神经酰胺三己糖苷（globotriaosylceramide，Gb3）分解代谢所必须。GLA基因的突变可引起α-Gal A功能部分或完全丧失，导致其代谢底物Gb3和相关鞘糖脂在人体的各器官、组织内积聚，造成多系统损害［2］。流行病学研究［3］显示，Fabry病的患病率为1 ∶117 000～1 ∶40 000，但这一患病率可能被低估，在一些国家的新生儿筛查中，患病率在1 ∶8 882～1 ∶1 368之间［4］。一项荷兰的队列研究［5］显示，受影响男性和女性的预期寿命的中位数分别为57岁和72岁。目前，Fabry病尚无治愈方法，主要采用人工重组α-Gal A治疗［6-7］。

目前，Fabry病的动物模型只有小鼠和大鼠，而小鼠和大鼠距离人类的亲缘关系较远，不能很好地复制Fabry病的病理过程。猪是除灵长类动物外与人类亲缘关系最近的物种之一，其解剖结构、生理生化指标、药物代谢和疾病发生发展等与人类十分相似。因此，猪是Fabry病模型的良好选择。建立人类Fabry病猪模型，有助于研究该病的病理过程，筛选药物和寻找特异性的生物标志等［8-9］。本研究通过生物信息学分析，比较了人/猪α-Gal A的相似性，并鉴别了猪α-Gal A的催化残基位置，为Fabry病猪模型的构建提供了理论支持；利用CRISPR/Cas9技术构建了GLA基因敲除的巴马公猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts，PFFs），为构建Fabry病动物模型提供实验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：35 d的巴马公猪PFFs为本实验室留存。

1.1.2 主要试剂与仪器：pX330质粒（货号42230）购自美国Addgene公司；DH5α感受态细胞和质粒抽提试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；BbsⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶和T7E1酶均购自美国New England Biolabs公司；Basic NucleofectorTMKits购自德国Lonza公司；DMEM培养液、G418药物、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青链霉素双抗和DPBS缓冲液均购自美国赛默飞世尔科技公司。单孔细胞核转染仪购自德国Lonza公司；生物安全柜购自美国赛默飞世尔科技公司。引物合成与DNA测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 人/猪α-Gal A的生物信息学分析：在NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载包括人和猪在内的16个物种的α-Gal A的氨基酸序列，采用MEGA X软件绘制系统进化树。采用DNAMAN软件对人和猪α-Gal A氨基酸序列进行比对，再用BLAST在线工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的Global Align程序计算二者的一致性和相似性。采用DNASTAR软件中的Protein模块，对人/猪α-Gal A进行二级结构分析，使用Chou-Fasman算法预测人/猪α-Gal A的α螺旋、β折叠、β转角的比例。使用 Swiss Model在线工具（https：//swissmodel.expasy.org/）对人/猪α-Gal A进行三维结构模拟，然后采用PyMOL软件比较两者三维结构的相似度，计算均方根偏差（root mean square displacement，RMSD）值。

1.2.2 猪α-Gal A催化残基的鉴别：使用在线工具BLAST中的CD-search程序，寻找猪α-Gal A的结构域和催化残基。输入猪α-Gal A的氨基酸序列，数据库选择保守结构域数据库（conserved domain database，CDD），为避免假阳性的出现，E值选择默认值0.01。

1.2.3 CRISPR/Cas9的靶点设计和打靶载体构建：根据NCBI数据库中的GLA基因序列，针对第三外显子设计扩增引物（反向引物序列为CCTGCCTGGAG TGTTTTTCTC；正向引物序列为TACTGAGGAAAGC CAGGGATG），进行PCR扩增测序，确定真实序列与数据库中GLA基因的差异。为确保酶完全失活，根据在线工具CRISPOR（http：//crispor.tefor.net/），在编码催化残基前的区域设计单链向导RNA（single guide RNA，sgRNA），并设计Oligo合成（GLA_sgRNA反向引物序列为CACCGTTGATCTGCTCAAATTCGA，GLA_sgRNA正向引物序列为AAACTCGAATTTGAGCAGA TCAAC）。载体构建的步骤包括引物退火、载体酶切和连接。用去离子水将sgRNA Oligo稀释至100 μmol/L。反应体系包括正链Oligo 1 μL，负链Oligo 1 μL，去离子水8 μL。37℃ 30 min，95 ℃ 5 min，再以-5 ℃/min的速度降至25 ℃。用BbsⅠ限制性内切酶对pX330质粒进行线性化，连接退火产物，转化入DH5α感受态细胞。挑取单菌落，测序鉴定。对连接成功的菌株进行扩增，利用试剂盒提取质粒。

1.2.4 细胞转染与单克隆细胞的筛选：在6 cm培养皿内复苏原代巴马猪PFFs（约2.6×106个），用含16%胎牛血清的全培养基（42 mL DMEM培养液、8 mL胎牛血清和500 μL青链霉素双抗），38.5 ℃、5% CO2的条件下培养约24 h，至细胞融合度达到90%以上。用0.05%胰酶消化2 min，1 200 r/min离心收集细胞。取5 μg打靶载体pX330-GLA和1 μg抗性质粒pHY54 SV40-neo，按照Lonza核转染试剂盒说明书转染细胞，程序为U-023。转染结束后，将细胞分盘至10 cm培养皿中，密度控制在4倍镜视野下细胞数约为30～40个。细胞培养24 h后，加1 mg/mL G418进行筛选。根据细胞状态降低药物浓度，药物筛选约9～12 d，四倍镜下观察细胞状态，单克隆长满1个四倍镜视野时，用记号笔在皿底圈出。DPBS清洗2遍，在标记处放置克隆环，加入0.25%胰蛋白酶，消化约2 min。无药全培养基终止消化，细胞悬液移至24孔板中，待细胞长满后，消化至12孔板中培养。留部分细胞在24孔板中继续培养，长满后消化并用NP40裂解细胞，提取基因组DNA用于PCR测序鉴定。

1.2.5 T7E1酶切法检测突变效率：将转染后未分盘的细胞放入6 cm培养皿中，24 h后换药培养，待细胞长满后，消化提取基因组。PCR扩增并回收目的片段。T7E1酶切体系包括纯化产物200 ng，10×NEB Buffer 2 2 μL，去离子水补至19 μL。PCR仪中退火，95 ℃ 5 min，-2 ℃/s，降至85 ℃；-0.1 ℃/s，降至25℃；4 ℃保存。体系中加入1 μL T7E1酶，37 ℃孵育15 min。之后每管加入4 μL 6×loading buffer，2%琼脂糖凝胶电泳1.5 h。计算突变效率，InDel（%）=［1-（1-裂解产物占比）1/2］×100。

2 结果

2.1 人/猪α-Gal A的相似性

用MEGA X软件绘制系统进化树，结果显示，与小鼠、大鼠和多种常见家畜相比，猪的进化距离与人更近（图1）。二者的氨基酸序列一致性为81%，相似性为89%。使用Chou-Fasman算法预测的人/猪α-Gal A的二级结构比例结果显示，人α-Gal A的α螺旋占29.4%，β折叠占19.8%，β转角占35.4%；猪α-Gal A的α螺旋占28.9%，β折叠占21.5%，β转角占35.1%（图2B）。二级结构的比例和排布十分相似，提示其三维结构也可能极其相似。采用Swiss Model在线工具对人/猪α-Gal A进行三维建模，再利用PyMOL软件比较两者三维结构的相似度，结果显示，RMSD值为0.012，亦说明其三维结构极其相似（图2C）。通过生物信息学分析发现人/猪α-Gal A在结构上高度相似，推测猪α-Gal A的功能和特征也可能与人高度相似，还需在体水平进一步验证。

图1 不同物种α-Gal A的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of α-Gal A in different species

图2 人/猪α-Gal A的一级、二级和三级结构分析Fig.2 Analysis of α-galactosidase A primary，secondary，and three-dimensional structures between human and pig

2.2 猪α-Gal A催化残基的鉴别

人α-Gal A的结构已被揭示，是一种同源二聚体蛋白，每个单体由2个结构域组成，分别是含有活性位点的一个（β/α）8桶状结构域和一个靠近C端含8条反向平行β折叠的结构域［10］。通过BLAST的CDsearch程序查询，找到猪α-Gal A的结构域也有2个，分别是43～326位残基的含活性位点的结构域和靠近C端的329～415位残基的结构域（图3A）。糖苷酶的催化机制是通过双重置换催化机制实现的，其中人α-Gal A的2次亲核攻击来自于第170位和第231位的天冬氨酸，对应于猪则是第174位和第235位的天冬氨酸（图3B）［10-11］。

图3 猪α-Gal A的结构域和催化残基的鉴别Fig.3 Identification of domains and catalytic residues of pig α-Gal A

2.3 CRISPR/Cas9打靶载体的构建

为确保猪GLA基因编码的α-Gal A完全失活，选择在编码第174位催化残基前的外显子区设计sgRNA［12］。测序结果如图4所示，pX330载体中成功插入了猪GLA基因靶点的sgRNA序列。

图4 GLA基因靶点和重组载体测序Fig.4 Target of GLA gene and sequencing of recombinant vectors

2.4 GLA基因敲除细胞系的鉴定

经测序鉴定，共获得52个阳性单克隆细胞。图5和表1展示了5种突变型，均造成移码突变，导致编码催化残基的区域被破坏。

表1 GLA敲除PFFs的基因型Tab.1 Genotypes of GLA-knockout PFFs

图5 GLA敲除PFFs的测序结果Fig.5 Sequencing results of GLA-knockout PFFs

2.5 T7E1酶切实验验证sgRNA的突变效率

PCR产物退火，再经过T7E1酶切后行凝胶电泳，结果显示目的片段被切成2段（图6）。通过公式计算得出突变效率为17.17%。

图6 sgRNA突变效率的T7E1酶切验证Fig.6 T7E1 cleavage assay of sgRNA mutation efficiency

3 讨论

Fabry病是一种X连锁的溶酶体贮积病。目前，Fabry病的动物模型只有小鼠和大鼠，但其病理表现，如血管角质瘤、眼部和脑血管等并发症均表现不完全［13-15］。因此，开发一种更好的动物模型有助于深入研究Fabry病的病理机制和诊疗策略。猪的心血管系统、消化系统、皮肤、营养需要、骨骼发育及矿物质代谢等与人相似，体型大小与人接近，繁殖数量多，周期短，是极佳的模型动物［16］。猪模型不仅能很好地复制多种小鼠不能准确和全面体现的人类疾病，还能提供更好的后期实验或试药条件［17-18］。本实验室已制备了ApoE基因敲除猪，成功复制了动脉粥样硬化模型［19］。还实现了GGTA1、β4GalNT2和CMAH三基因敲除的猪，为异种移植提供了可能［20］。

由于GLA基因位于X染色体，本研究选择巴马公猪的细胞进行敲除，以避免杂合敲除的情况。本研究利用生物信息学方法对人/猪GLA基因编码的α-Gal A相似性进行分析，并鉴定出猪α-Gal A的催化残基位置。为确保酶完全失活，通过在线工具在猪α-Gal A编码催化残基前的外显子区制造移码突变，成功构建CRISPR/Cas9打靶载体，将打靶载体与抗性质粒共转染至巴马公猪胎儿PFFs，用G418药物筛选出单克隆细胞，并行PCR测序鉴定其基因型。结果显示，人/猪α-Gal A的氨基酸序列一致性为81%，相似性为89%；三维结构的RMSD值为0.012。猪α-Gal A的催化残基是第174位和第235位的天冬氨酸。

综上所述，本研究成功地构建了GLA基因敲除的巴马公猪PFFs，为后续体细胞核移植和胚胎移植提供了供体细胞，为构建人类Fabry病猪模型奠定了研究基础，为人类Fabry病的进一步探索提供了合适的动物模型。