青蒿鳖甲汤合西北燥证经验方对阴虚内燥型围绝经期焦虑大鼠的影响❋

刘爱玲， 马 丽， 周 光△

(1.新疆医科大学， 乌鲁木齐 830011；2.中国科学院新疆理化技术研究所， 乌鲁木齐 830011)

围绝经期焦虑症是指初次发病于围绝经期，以焦虑不安、精力缺乏为主要症状的疾病，属于情感性精神障碍。围绝经期妇女因肾气渐衰、天癸将竭、冲任虚损、精血不足而致阴阳失调。女性多郁易怒，且受生物因素、社会环境等影响，出现烦躁易怒、惊恐不安、睡眠差等一系列精神障碍，从而导致焦虑症的发生[1]。围绝经期焦虑症的发病率是绝经前期的2～2.5倍[2，3]。新疆地区围绝经期相关病证研究显示，中医证型以阴虚内燥为主，并有其地域特点[4]。青蒿鳖甲汤合西北燥证经验方由青蒿、鳖甲、生地黄、知母、牡丹皮、桑椹、玫瑰花组成，具有养阴透热之功效，临床常用于改善阴虚内热。本研究就青蒿鳖甲汤合西北燥证经验方对阴虚内燥型围绝经期焦虑大鼠模型的影响展开研究，以探究其作用机制。本研究通过新疆医科大学实验动物伦理审查委员会批准(批号20140304-136)。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD雌性大鼠40只，体质量149.7 g～206.5 g，购自新疆医科大学实验动物中心。饲养于新疆医科大学实验动物中心SPF级屏障环境实验室，温度20～26 ℃，相对湿度40%～70%,光照节律12 L∶12 D。

1.2 药物及制备

青蒿鳖甲汤合西北燥证经验方药物组成：青蒿、知母各6 g，牡丹皮、桑椹、玫瑰花各9 g，生地黄12 g，鳖甲15 g，每剂饮片常规煎煮2次，煎液合并过滤、混合后浓缩至含生药量0.6 g/mL，每日1次，煎煮器具及标准一致，冷却至室温备用。经新疆维吾尔自治区中医医院中药师凯丽比努尔·阿力甫鉴定药材质量合格。热性造模剂由附子、干姜各75 g组成，常规煎煮2次，煎液合并过滤、混合后浓缩至含生药量1 g/mL，每日1次，冷却至室温备用(药物来源及制作标准同上)；丁螺环酮片，江苏恩华药业股份有限公司，国药准字(H19991024)；“五三粉”饲料由五香粉250 g、辣椒粉150 g、胡椒粉50 g、花椒粉50 g组成，购自新疆笑厨食品有限公司，货号(20171227)，放入50 kg大鼠普通饲料中，制备成1%比例的“五三粉”饲料。

1.3 主要试剂及仪器

血清脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF,货号JL12910)、雌二醇(estradiol，E2，货号JL11473)、孕酮(progesterone，PROG,货号JL15546)、促黄体激素(luteinizing hormone，LH,货号JL21049)、催乳素(prolactin，PRL,货号JL12505)、睾酮(testosterone，T,货号JL11473)、血清促卵泡素(follicle-stimulating hormone，FSH,货号JL13251)、Elisa检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)。

MPA6型多功能皮肤测试仪，德国CK公司；自制高架十字迷宫(elevated plus-maze，EPM，开放臂：50 cm，闭合臂：50 cm，臂高：30 cm，离地高度：45 cm)；GX-500A型陶瓷煎药壶，潮州市潮安区东凤广兴五金燃具厂；Multiskam GO1510型酶标仪，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。

1.4 分组与造模

适应性喂养3 d后，40只大鼠按随机数字表法分为假手术组、阴虚内燥型围绝经期焦虑组(模型组)、青蒿鳖甲汤合西北燥证经验方组(中药组)、丁螺环酮片组(西药组)，每组各10只。

1.4.1 围绝经期大鼠模型的建立 参照文献采用“去卵巢模型”造模方法[5]，实验第1天各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，除假手术组外，其余大鼠手术结扎卵巢下输卵管并切除双侧卵巢。术后第5天开始，对动物进行阴道脱落细胞涂片检查，连续5 d未见动情周期样改变则提示造模成功。

1.4.2 阴虚内燥型围绝经期大鼠模型的建立 除假手术组外，其余大鼠在术后第10天开始灌服热性中药造模剂10 mL/(kg·d)，并饲喂“五三粉”饲料，不限食，保持安静，连续灌胃、饲喂4周。大鼠呈现舌尖色红，口唇干燥脱皮，大便干，皮肤角质层含水量下降，体质量增长缓慢，则提示阴虚内燥型围绝经期大鼠模型造模成功。

1.4.3 阴虚内燥型围绝经期焦虑大鼠模型的建立 参照文献采用“不确定空瓶应激法”[6]，除假手术组外，其余各组大鼠实验第10天在灌胃热性中药和饲喂“五三粉”饲料的同时，开始每天仅在10∶30～10∶40 和 19∶00～19∶10给水，1周后在此饮水时间段内各组无规律地给予24 h空瓶饮水刺激，连续3周。结束后采用高架十字迷宫试验 (elevated plus-maze,EPM)评价模型焦虑程度，建立阴虚内燥型围绝经期焦虑大鼠模型。

1.5 给药方法

实验第38天造模结束后次日，经口灌胃给予假手术组、模型组动物蒸馏水，中药组青蒿鳖甲汤合西北燥证经验方(5.94 g生药/kg)，西药组丁螺环酮片(1.8 mg/kg，按体表面积换算)，各给药组的给药体积均为10 mL/(kg·d)，连续治疗14 d后停药。

1.6 指标检测

1.6.1 一般情况 观察动物毛色、排泄物、口唇皮肤黏膜、舌色并及时进行记录，每周1次。

1.6.2 体质量检测 雌鼠在适应性喂养3 d后称重为造模前体质量，术后10 d开始每周定期称重并记录。

1.6.3 皮肤角质层含水量测定 大鼠背部剃毛2 cm×2 cm，将MPA6多功能皮肤测试仪水分测试探头垂直地轻压在被测皮肤表面，测量并记录皮肤角质层含水量，适应性喂养3 d后检测记录为造模前皮肤角质层含水量，阴虚内燥型围绝经期焦虑大鼠造模成功时检测记录为造模后皮肤角质层含水量。

1.6.4 阴道脱落细胞学检测 用拇指和食指捏住雌鼠尾巴，其余3指轻压雌鼠后腰背部，提起尾巴露出阴道口，用移液器吸取100 μL 0.9%氯化钠溶液，滴入大鼠阴道吹打数次，后吸出阴道内液体，制备阴道脱落细胞涂片，固定后行甲苯胺蓝染色，术后第5天开始每天1次，连续5 d。

1.6.5 高架十字迷宫试验 在末次给药后，各组动物进行EPM测试[7]。测试前将大鼠提前5 min单独放置在一个白色盒中适应新环境，随后将大鼠放置于EPM架的中央，使其头部朝向开放臂的一侧，释放后记录大鼠5 min内进入开放臂次数、开放臂停留时间、进入闭臂次数和闭臂停留时间。

1.6.6 Elisa法测定血清BDNF及性激素含量 末次给药结束后麻醉各组动物，腹主动脉采集3～5 mL全血，离心取上清液保存于-80 ℃，Elisa法检测大鼠血清BDNF、E2、FSH、T、PRL、LH、PROG含量，操作严格参照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况、体质量及皮肤角质层含水量观察结果

表1示，与假手术组比较，造模结束后大鼠毛色色暗，舌尖红，口唇偏干，大便干结。造模前各组大鼠皮肤角质层含水量比较差异无统计学意义。造模后与假手术组比较，模型组皮肤角质层含水量均显著下降(P<0.01)。造模前各组大鼠体质量比较差异无统计学意义，造模后与假手术组比较，模型组体质量显著下降(P<0.01)。

表1 各组大鼠皮肤角质层含水量与体质量变化比较

2.2 去势造模后阴道脱落细胞涂片观察结果

图1示，假手术组大鼠动情间期阴道内以白细胞为主，动情前期具有大量核上皮细胞和少数角化上皮细胞，动情期以角化上皮细胞为主且偶见白细胞，动情后期可见角质化上皮细胞和白细胞，生殖道内发生分解代谢和退化性改变。与假手术组大鼠比较，卵巢切除后第5天开始，连续5 d对动物进行阴道脱落细胞涂片检查，未见有动情周期的变化，说明大鼠去势成功。

注：A.假手术组；B.围绝经期造模动物；d1为第1天图1 阴道脱落细胞涂片检查结果比较(甲苯胺蓝染色×100)

2.3 各组大鼠EPM行为学检测结果比较

表2示，与假手术组比较，模型组大鼠进入开放臂次数明显减少(P<0.05)，在开放臂停留时间明显缩短(P<0.05)，进入闭臂次数明显增加(P<0.05)。与模型组比较，中药组进入开放臂次数明显增加(P<0.05)，在开放臂停留时间明显延长(P<0.05)，进入闭臂次数明显减少(P<0.05)；西药组进入开放臂次数显著增加(P<0.01)，在开放臂停留时间显著延长(P<0.01)，进入闭臂次数显著减少(P<0.01)，在闭臂停留时间显著缩短(P<0.01)。

表2 各组大鼠高架十字迷宫行为学检测结果比较

2.4 各组大鼠血清BDNF及性激素6项含量比较

表3示，与假手术组比较，模型组大鼠血清BDNF、E2、T、PRL、PROG均显著下降(P<0.01)，FSH、LH显著上升(P<0.01)。与模型组比较，中药组大鼠血清BDNF显著上升(P<0.01)，PRL、PROG明显上升(P<0.05)；西药组大鼠血清BDNF、E2、PRL、PROG均显著上升(P<0.01)，FSH、LH均显著下降(P<0.01)。

表3 各组大鼠血清BDNF及性激素6项含量比较

3 讨论

围绝经期是女性周期性生理改变的重要时期之一，也提示女性卵巢功能处于持续性衰退中[8]。女性从该时期起不再排卵，并会出现各种不同程度的植物神经紊乱及内分泌失调等症状。随着性激素水平的不断下降，会出现各种围绝经期生理、心理以及激素水平的改变直至绝经。这一时期易出现失眠多梦、潮热、烦躁易怒等症状，尤其以焦虑等情感性精神障碍更为多见，可能会影响家庭和谐及社会安定。女性从青春期至绝经后几年一直处于焦虑症高发阶段，尤其是在45～54岁年龄段患病率最高，约为男性患病率的1.7～2.7倍[9]。因此，提高生活质量成为广大中老年女性的迫切诉求，关爱围绝经期女性身心健康也成为世界公共卫生问题。

“西北燥证”是以口鼻、咽喉、肌肤干燥和干咳、烦躁等各种不适症状为特征的中医证候，因其发生于西北地区，且以干燥症状为主，所以被称为“西北燥证”。由于新疆特殊的地域气候环境，“西北燥证”关联生殖病证多发，尤其是女性月经紊乱、月经过少、闭经等[10]。围绝经期焦虑症属于中医“妇人脏躁”范畴，脏阴不足、五脏失养而情志异常。新疆围绝经期病证证型以阴虚内燥证为主[11]，因此推测阴虚内燥证可能也是新疆居民围绝经期焦虑症的主要证型，“西北燥证”可能是新疆居民围绝经期焦虑症脏阴不足、五脏失养、情志异常之阴虚内燥证的主要背景因素。

青蒿鳖甲汤出自清·吴鞠通《温病条辨》,由青蒿、鳖甲、细生地、知母、牡丹皮 5 味药物组成。方中以鳖甲直入阴分，滋阴退热；青蒿芳香清热透络，两药相配内清外透，使阴分伏热有外透之机。吴塘自释：“此方有先入后出之妙，青蒿不能直入阴分，有鳖甲领之入也；鳖甲不能独出阳分，有青蒿领之出也。”生地黄滋阴凉血；知母苦寒质润，滋阴降火，二者助鳖甲养阴退虚热；牡丹皮泄血中伏火，以助青蒿清透阴分伏热。方剂功用养阴透热与围绝经期焦虑症之阴虚内热证方证相应；新疆名老中医刘继祖结合西北地域多燥特点,认为女性围绝经期病证是因肾精血不足、肝阴匮乏、肝阳上亢、心火独旺而致的肾燥、肝燥等脏燥病。且燥多挟虚,其虚为本,其燥为标。因地域之外燥者,其燥为病因，内燥者其燥为病果,由此提出“虚燥论”的学术思想,以新疆地产中草药桑椹、玫瑰花调补冲任、滋肾养肝、平肝安神、养血润燥,为治疗围绝经期脏燥病证经验药组[12]。本研究实验方剂配伍既体现出“方证相应”的经典辨证组方用药规律，又遵循针对局域病证特点的临证治疗经验。

本研究采用“五三粉”在围绝经期大鼠模型基础上制备阴虚内燥型围绝经期焦虑模型，与围绝经期模型组比较，阴虚内燥型围绝经期焦虑组大鼠皮肤角质层含水量明显下降，性激素6项水平变化明显，血清E2、T、PRL、PROG含量降低，FSH、LH含量升高。在给予青蒿鳖甲汤合西北燥证经验方治疗后，进入开放臂的次数增加且时间延长，性激素6项水平改善优于阴虚内燥型围绝经期焦虑组。当E2降低、FSH升高时，会引起下丘脑-垂体-卵巢轴功能失调，导致LH和FSH的进一步增加，反射性抑制大脑皮质功能出现自主神经功能紊乱，从而引起包括围绝经期焦虑症在内的围绝经期综合征及恶性循环。本研究结果显示，青蒿鳖甲汤合西北燥证经验方从改善阴虚内燥入手，滋阴降火，疏肝解郁，方证对应，显示出明显的抗焦虑作用。本研究可为进一步开展阴虚内燥型围绝经期焦虑症适宜性防治方案研究提供实验依据。