金银花营养品质评价体系的构建

梁慧珍，谭政委，余永亮，杨红旗，许兰杰，杨 青，李春明，董 薇，李 磊，鲁丹丹，安素妨

（1 河南省农业科学院芝麻研究中心 郑州 450002 2 河南省农业科学院西峡分院 河南西峡 474550）

金银花（Lonicera japonica Thunb.）为忍冬科忍冬属植物[1]，是我国传统的大宗药材，也是我国重点管理的名贵中药材，同时又是食品物质，被国家卫健委列入“药食同源目录（2018）”[2]。其主要成分有挥发油类、有机酸类和黄酮类等，具有广谱抗菌，疏散风热，清热解毒，保肝利胆等功效[3-4]。绿原酸（Chlorogenic acid）是金银花最有效的成分，具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等显著功效[5-6]。河南省和山东省是金银花主产区，河南密银花、封丘金银花、山东金银花均为我国道地金银花产品，在国内外享有盛誉，其药用和营养健价值越来越受到国家和地方政府、科研机构的重视，对金银花品质的要求也越来越高，然而，不同产地的金银花品质存在差异[7]。近年来，国家大力推进乡村振兴和精准扶贫政策，金银花产业逐渐兴起，市场价格出现波动，同时，金银花花期采摘机械化程度不高，劳动力需求量较大，必然导致金银花市场风险，需要细分市场需求，为实现供给侧改革需要，筛选营养品质最优的金银花材料，定向培育优质金银花新品种，以满足不同的市场需求。建立金银花营养品质评价体系具有重要的现实意义。目前，对植物营养品质的评价体系，主要集中在香菇[8]、生姜[9]、番茄[10]、苹果[11]、桑[12]和桃子[13]、菜籽粕[14]、赤松[15]、新疆干果[16]等，对金银花营养品质评价体系的报道较少。本研究以138 份不同产地的金银花资源为试验材料，采用高效液相色谱法（Highperformance liquid chromatography，HPLC） 和紫外分光光度法（Ultraviolet spectrophotometry）测定金银花7 种营养物质——绿原酸 （Chlorogenic acid，C）、芦丁（Rutin，R）、木犀草苷（Luteoloside，LS）、异绿原酸A（Isochlorogenic acid A，IA）、异绿原酸C（Isochlorogenic acid C，IC）、木犀草素（Luteolin，LI） 和总黄酮（Flavonoids，F） 的含量。采用SPSS 20.0 软件进行主成分分析 （Principal component analysis，PCA） 和相关分析，通过熵权法（The entropy weight method，EWM）、灰色关联度分析（Grey relation analysis，GRA）和主成分分析建立金银花营养品质综合评价函数，通过概率分布建立金银花营养品质综合评分标准。评价体系将为金银花的综合利用、优异金银花种质筛选、品质改良和新品种选育提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：138 份金银花干燥花蕾样品，来自河南省现代农业科技试验示范基地（113°42′24″E，35°00'36"N）。这些试验材料原产地分别为：河南新密（HNXM，试验编号01-06）、河南封丘（HNFQ，试验编号07-14）、河南原阳（HNYY，试验编号15-56）、山东平邑（SDPY，试验编号57-66）、山东日照（SDRZ，试验编号67-76）、山东济宁（SDJN，试验编号77-86）、河北巨鹿（HBJL，试验编号87-92）、山西临汾（SXLF，试验编号93-100）、甘肃宕昌（GSTC，试验编号101-138）。

试剂：对照品绿原酸（Chlorogenic acid），日本TCL；芦丁（Rutin）、木犀草苷（Luteoloside）、木犀草素（Luteolin），国药试剂；异绿原酸A（Isochlorogenic acid A）、异绿原酸C （Isochlorogenic acid C），成都曼思特生物科技有限公司；色谱纯甲醇（CH3OH）、乙醇（C2H5OH）、乙腈（C2H3N），生工生物工程上海（股份）有限公司；无水三氯化铝（AlCl3）、亚硝酸钠（NaNO2）、氢氧化钠（NaOH）均为分析纯级，天津市风船化学试剂科技有限公司；纯净水（H2O），杭州哇哈哈集团。

1.2 仪器及设备

Agilent/安捷伦1260 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；KQ3200DE 数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；UV-3200 紫外可见分光光度计，海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金银花活性成分测定 参照谭政委等[7]和李淼等[17]的方法，采用高效液相色谱法（HPLC）测定金银花的化学成分。

1.3.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相：乙睛C2H3N（B）-0.3%磷酸水溶液（A）。梯度洗脱：0～11 min，82%～90%A，11～30 min，80%～82%A；30～40 min，80%A；40～50 min，75%～80%A；50～60 min，70%～75%A。检测波长：348 nm；体积流量：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。

1.3.1.2 混合对照品和供试品溶液的制备 混合对照品溶液：分别精密称取绿原酸（Chlorogenic acid）、芦丁（Rutin）、木犀草苷（Luteoloside）、异绿原 酸A （Isochlorogenic acid A）、异绿原酸C（Isochlorogenic acid C）和木犀草素（Luteolin）对照品，放置于10 mL 棕色容量瓶中，加入70%的甲醇溶液溶解、定容，得到质量浓度分别为0.646，0.290，0.400，2.980，0.100，0.190 mg/mL 的 混 合 对照品溶液。

供试品溶液：将烘干后的金银花样品进行粉碎、过筛，称取0.5 g 样品粉末置于三角瓶中，加入25 mL 甲醇溶液（体积分数70%）摇动均匀，采用频率40 kHz，功率150 W 进行超声处理40 min，摇匀后过滤备用。

1.3.1.3 精密度试验 取同一混合标准品溶液，按照1.3.1.2 节的样品溶液制备方法将所得溶液经0.22 μm 滤膜过滤，连续进样6 次，按照每次进样10 μL 进行测定，记录峰面积。经计算峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为0.35%，0.51%，0.29%，0.17%，1.31%，0.39%，试验精密度良好。

1.3.1.4 重复性试验 取同一批金银花样品6份，按1.3.1.2 节的样品溶液制备方法制备，按照每次进样10 μL 进行测定，记录峰面积。经计算RSD 分别为0.62%，0.28%，1.24%，0.47%，1.07%，2.04%，试验重复性良好。

1.3.1.5 稳定性试验 取同一批金银花样品6份，按1.3.1.2 节的样品溶液制备方法制备，按1.3.1.1 节的色谱条件检测，分别于0，4，8，16，24，32 h，每次进样10 μL 进行测定，记录峰面积。经计算RSD 分别为0.65%，2.28%，2.23%，0.67%，1.52%，2.81%，试验稳定性良好。

1.4 总黄酮含量的测定

参照樊深等[18]的方法，用紫外分光光度计法（Ultraviolet spectrophotometry）测定和计算金银花提取物的总黄酮含量。

1.4.1 金银花提取液的制备 将烘干后的金银花样品粉碎、过筛后，称取样品粉末0.25 g，加入25 mL 乙醇（体积分数50%），进行超声处理（温度50℃，频率40 kHz，功率150 W，时间35 min）后过滤备用。

1.4.2 金银花总黄酮的测定 以芦丁 （Rutin）为标准样，采用紫外分光光度计法（Ultraviolet spectrophotometry） 在510 nm 波长处比色定量测定金银花总黄酮含量。操作步骤为：称取芦丁（Rutin）0.0207 g （温度120 ℃干燥处理），用为70%的甲醇（CH3OH）溶液定容至100 mL，获得质量浓度为0.227 mg/mL 的标准应用液。分别吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 标准应用液放置于6 支试管中，加入30%的乙醇（C2H5OH）溶液至5 mL，然后再加入0.3 mL 5%的亚硝酸钠（NaNO2）溶液，混合均匀后静置6 min，然后加入0.3 mL 10%的三氯化铝（Al2O3）溶液，混合均匀后静置6 min，然后再加入4 mL 浓度为1 mol/L 的氢氧化钠（NaOH）溶液，再加入0.4 mL 水，混合均匀后静置15 min，测定吸光度（波长510 nm），计算总黄酮含量。

1.5 数据分析

1.5.1 统计分析 采用SPSS 20.0 软件Duncan's方法进行显著性分析（P＜0.05 表示差异显著）；采用Excel 2018 进行数据整理和相关分析。

1.5.2 灰色关联模型分析 参照高琦等[19]的灰色关联模型，通过数据无量纲化，消除各量纲的指数差异，计算参考序列与比较序列的灰色关联系数。采用熵权法[20]计算加权关联度。熵权法、灰色关联分析与主成分分析相结合，建立金银花营养品质综合评价函数。

公式（1）中，ξn（K）——各项指标灰色关联系数；ξ——分辨系数，本研究取值0.5。

公式（2）中，Xi——加权关联度；n——指标个数；ω——加权系数；ξi（k）——关联系数。

公式（3）中，ω——加权系数；n——指标个数；Ej——指标贡献率。

2 结果与分析

2.1 不同产地金银花营养成分分析

来自不同地区的138 个参试材料绿原酸（Chlorogenic acid，C）、木犀草苷（Luteoloside，LS）、芦丁（Rutin，R）、异绿原酸A（Isochlorogenic acid A，IA）、异绿原酸C（Isochlorogenic acid C，IC）、木犀草素（Luteolin，LI）和总黄酮（Flavonoids，F）含量7 个营养成分的变异特征如表1所示。不同产地金银花营养成分总体上差异较大，变异系数为8.32%～71.23%。除F 相对不大之外（8.32%），其余5 个成分的变异系数为23.32%～71.23%，相对较大。特别是LI 变异最大，达到71.23%。其中，6 个成分中，HNXM 产区C 和F 2 个成分含量最高，分别达到14.654 mg 和0.681 mg/mL，LS 成分含量最低，为0.456 mg；GSTC 产区R、LS、LI 3 个成分含量最高，分别达到0.745，0.886，0.330 mg，C和F2 个成分含量最低，分别为10.112 mg 和0.601 mg/mL；HNYY 产区IA、TC 2 个成分含量最高，分别达到25.670 mg 和1.784 mg；SDRZ 产区R、IC 2 个成分含量最低，分别为0.059 mg 和1.127 mg；SDJN 和HBJL产区分别在IA 和LI 2个成分含量最低，分别为15.089 mg 和0.084 mg。显著性分析表明，C 在HNXM、HNFQ、HNYY 产区含量差异显著且均与SXLF、GSTC 产区含量差异显著；R 在GSTC、SXLF、SDRZ 含量差异显著且均与HNXM、HNFQ 产区含量差异显著；LS 在GSTC、SXLF、HBJL、HNXM 产区含量差异显著；IA在HNYY 与SDPY、SDRZ、SDJN 产区含量差异显著；IC 在HNYY 与SDPY、SDRZ、SDJN、HBJL 产区含量差异显著；LI 在SDLN、GSTC 含量差异显著且均与HNYY、HNJL、SXLF 产区含量差异显著；F在HNXM、SDJN 含量差异显著且均与HBJL、GSTC 含量差异显著。说明这7 种成分均受到环境的影响，而影响程度各有不同。该研究结果对于评价不同产地金银花各营养成分含量具有重要的参考价值，有利于根据市场需要进行定向选择，也可以为育种家选育专用型新品种提供产区参考。

表1 不同品系金银花内在成分含量结果Table 1 Results of internal component content in different lines of honeysuckle

2.2 不同产地金银花营养成分相关性分析

相关性分析中通过相关系数比较各性状间的显著性和密切程度。植物代谢过程中，往往存在一定的相关性，推动了植物性状的直观分析和化学成分合成代谢分析的进程[21]。金银花各营养成分间的相关系数详见表2。结果表明，LS 与C 和R含量、IA 与IC 含量、F 与IA 和IC 含量表现出极显著正相关；LI 与IA 和IC 表现出极显著负相关，F 与LI 表现出极显著负相关。说明金银花不同营养成分间存在一定的相关性。

表2 金银花营养成分相关性分析Table 2 Correlation analysis of nutritional components in honeysuckle

2.3 金银花营养品质综合评价体系的建立

2.3.1 金银花营养成分因子分析 本研究检测了金银花7 个营养成分的含量，变量数量较多，相互间关系比较复杂。通过主成分分析，把多个指标降维成少数几个综合指标[22]。运用SPSS 20.0 软件对参试金银花样品7 个营养成分测定结果进行主成分分析。依据信息量损失≤15%、累计贡献率＞85%的原则，计算出主成分因子载荷和贡献率，详见表3。方差贡献率结果表明，前3 个主成分分别为44.339%，23.930%，18.382%，累计贡献率为86.651%。这3 个主成分基本上可以还原色谱信息，分别定义为PC1、PC2、PC3。表3表明，IA、IC和LI 含量荷载较大，与PC1 相关程度较高；C 和LS 含量荷载绝对值较大，与PC2 相关程度较高；R和F 含量荷载绝对值较大，与PC3 相关程度较高。因此，将3 个主成分命名为：PC1 包括IA、IC 和LI；PC2 包括C 和LS；PC3 包括R 和F。将7 个营养成分指标降维成3 个主成分因子。根据每个主成分因子的权重值和特征值，得到3 个因子的判别函数如下：

表3 各主要性状主成分的因子载荷和贡献率Table 3 Factor load and contribution rate of principal components of main characters

函数表达式中，y1、y2、y3分别表示主成分1、主成分2、主成分3，x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7分别表示变量C、R、LS、IA、IC、LI、F 含量。

2.3.2 熵权法赋予权重 对不同产地金银花营养品质综合评价时，由于7 个营养成分含量差距较大，各项指标对评价结果的重要程度并不完全一致。为使评价结果更加客观实际，可以通过权重系数来反映。权重系数越大，表明重要程度越高，对评价结果的影响越显著[23]。本研究采用客观赋权法中的熵权法对各评价指标赋予权重，结合灰色关联法对不同产地金银花营养品质综合评价。采用公式（3）计算各指标的权重系数，得到C、R、LS、IA、IC、LI、F 含量的信息熵分别是0.826，0.860，0.534，0.839，0.791，0.542 和0.751，赋予的权重系数分别为0.071，0.044，0.301，0.061，0.099，0.294和0.130。详见表4。

表4 评价指标的权重系数Table 4 Weight coefficients of evaluation indicators

2.3.3 灰色关联度分析 依据灰色关联度理论，建立灰色系统时，把所有试验品种都作为系统中的一个因素，使用关联度分析各因素的关联程度。关联度数值越大，性状越优。依据各指标关联度大小，赋予各指标不同的权重，计算各指标的加权关联度。

以3 个主成分为自变量，以关联度为因变量进行回归分析，得到回归方程y=0.324-0.019x1+0.024x2-0.011x3。将回归方程去标准化，得到多元线性回归模型，即金银花营养品质评价模型：

式中，x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7分别表示变量C、R、LS、IA、IC、LI、F 含量。

利用该模型，对138 个参试金银花样本进行计算，根据综合得分结果进行分级，共分为6 个级别，详见表5。

表5 金银花营养品质综合评分标准Table 5 Comprehensive evaluation standard of nutritional quality of honeysuckle

3 结论

作物的品质性状大多是受多基因控制的数量性状，受环境影响较大[24]。因此，对种质资源进行多指标综合评判，对于种质营养品质最佳材料筛选和品种改良具有重要的指导意义[25]。本研究中，选取了来自全国各大主产区的138 种金银花材料，变异类型丰富，营养价值高，主要营养成分齐全，然而变量元素多，分析计算比较复杂，为此，采用PCA 方法降维，选取具有代表性的、数量尽可能少的主成分来描述多种指标之间的联系。通过PCA 将7 个营养组分指标简化为3 个主成分因子，PC1 包括异绿原酸A、异绿原酸C 和木犀草素；PC2 包括绿原酸和木犀草苷；PC3 包括芦丁和总黄酮。3 个主成分贡献率分别为44.339%，23.930%和18.382%，累计贡献率为86.651%。采用熵权法、灰色关联度分析法和主成分分析，建立金银花营养品质综合评价函数，y=0.049x1-0.018x2+0.106x3+0.088x4+0.067x5+0.335x6+0.055x7+0.282。通过概率分布建立金银花营养品质综合评分6 级标准。利用评价体系对金银花资源营养品质进行综合分析，可以得到更加客观的营养评价结果，为筛选营养品质最优的金银花材料提供依据。该研究结果实际利用价值较大。