基于高通量测序解析不同品种蓝莓表面菌群结构的多样性

曹 森，董立超，张 鹏，薛友林，贾晓昱，李江阔

（1 贵阳学院食品与制药工程学院 贵阳 550005 2 辽宁大学轻型产业学院 沈阳 110036 3 天津市农业科学院农产品保鲜与加工技术研究所 天津 300384 4 国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津） 农业农村部农产品贮藏保鲜重点实验室天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室 天津 300384）

蓝莓（Vaccinium sp.）属于小浆果类，其果实口感十分细腻、鲜嫩、多汁，然而，在生长、采收、装卸和运输过程中极易造成机械损伤，使其受到病菌侵染，进而出现采后的各种病害，使蓝莓的贮藏和货架期缩短，严重影响着蓝莓产业的良性发展[1]。了解不同品种蓝莓采后的微生物病害发生规律，并制定出具有针对性的有效防治措施显得十分重要。蓝莓采后病害主要是由病原真菌引起，采后病害的出现与不同蓝莓品种自身抗性、贮藏时的温度、湿度及果实采摘时间关系密切。国内外学者在蓝莓病害发生规律及防治方面做了许多研究。1973年，Milholland[2]在美国东南部北卡罗来纳州的蓝莓中首次发现的链格孢菌（Alternaria sp.）是高丛蓝莓采后病害的主要致病菌，并提出使用药剂处理对链格孢菌的防效能力较差，抑制链格孢菌侵染的最佳方法是控制蓝莓采后贮藏温度；Smith 等[3]发现不同品种的兔眼蓝莓在采后病害中存在抗性差异；Mari 等[4]提出拮抗生防菌可促进采后蓝莓产生拮抗物质，促进蓝莓发生防御反应，从而减少蓝莓采后病害的出现。杨蕾等[5]在采后腐烂蓝莓中分离鉴定出青霉菌（Penicillium digitatum）和枝孢菌（Cladosporium tenuiussimum），试验发现BS-3 菌株对两种菌的抑菌效果达90%以上，有潜在的生防利用价值。

目前国内研究蓝莓采后病害主要集中在蓝莓产地方面，对品种间的差异方面研究较少。在贵州区域，2015年周笑犁等[6]报道，采后的蓝莓主要是由拟盘多毛孢（Pestalotiopsis sp.）、青霉菌（Penicillium sp.）和枝孢霉（Acremonium sp.）等致病菌侵染而发生病害；同年，郭晓月等[7]发现中国云南区域蓝莓贮藏期的致病菌为枝孢霉（Acremonium sp.）、链格孢菌（Alternaria sp.）和匍柄霉属（Stemphylium sp.）真菌。2016年，在辽南地区，戴启东等[8]从蓝莓病害果实中分离灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）、链格孢菌（Alternaria sp.）、青霉菌 （Penicillium sp.） 和粉红单端孢菌（Trichothecium roseum.）4 种致病菌。

长期以来，国内学者对果蔬采后病害方面的研究大多数为微生物的传统纯培养和鉴定。其分离鉴定出的致病菌仅为样本中较小的一部分。如今，高通量技术应用于检测土壤多样化[9-11]、海洋食品[11-13]、肠道环境[14-16]、发酵食品[17-20]等领域的微生物群落。其中，在食品微生物领域通常采用16S rRNA 高通量测序技术检测微生物群落的多样性。本研究以天津市蓟州区北陆、蓝金、莱克西、奥尼尔蓝莓为研究对象，采用高通量测序技术测序不同品种蓝莓表面菌群的ITS1 区，明确各品种蓝莓的优势菌群，为蓝莓品种选育、病害研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

北陆、莱克西、奥尼尔、蓝金蓝莓于2020年6月采自天津市蓟州区海阔家庭农场 （117.64 °N，40.09°E），采摘大小均匀、品质良好的果实装入小篮内，采收6 h 内空调车运至实验室。每个品种随机挑选约80 g 蓝莓果实，立即液氮速冻，于超低温（-80 ℃）冰箱保存。每个品种随机取出多颗果实进行测定，混样提取DNA 分别建库。

台式离心机 （Pico-21），赛默飞世尔科技公司；PCR 仪（T100TM Thermal Cyele）、凝胶成像系统（ChemiDocTMMP），美国伯乐公司；电泳仪电源（DYY-6C）、电泳槽（DYCZ-21），北京市六一仪器厂；荧光计（Q32866QubitR3.），美国英杰生命技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试材处理 对供试的样本分别进行标记，北陆、莱克西、奥尼尔、蓝金蓝莓分别标注为A、B、C、D。

1.2.1.1 蓝莓果实基因组DNA 的提取及PCR 扩增 果实基因组DNA 的提取采用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB），采用Barcode 的特异引物、Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 和酶进行PCR 扩增。

ITS1 区引物 （ITS5-1F-F 和ITS1-1F-R）：ITS1-1F-F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'；ITS1-1F-R：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'。

1.2.1.2 PCR 产物的检测和建库 使用质量分数为2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，蓝莓果实样本文库采用 TruSeq®DNA PCR -Free Sample Preparation Kit 试剂盒进行构建，并经过Qubit 和Q-PCR 定量，最后使用NovaSeq6000 上机测序。

1.2.2 数据筛选 从下机数据中使用PCR 扩增引物序列和Barcode 序列拆分出不同品种蓝莓数据，去除引物序列和Barcode 后，使用FLASH[21]逐个对不同品种蓝莓的reads 进行拼接，获得原始的Tags 数据（Raw Tags），并将其过滤处理[22]得到每个不同样本的高质量Tags 数据（Clean Tags）。参照Caporaso 等[23]的Tags 质量控制流程进行处理：将Raw Tags 从连续低质量值（阈值为≤19）碱基数达到长度3 的第1 个低质量碱基位点截断，随后过滤掉连续高质量碱基长度小于75%长度的Tags。经过上述处理后的Tags 数据通过[24]与其注释数据库进行比对，并去除嵌合体序列[25]，剩余有效数据（Effective tags）。

1.3 数据处理

1.3.1 OTU 聚类和物种注释 Effective Tag 的聚类采用Uparse 软件[26]，结果以97%的序列聚类成为OTUs（Operational taxonomic units），使用Qiime软件中的blast 方法[27]与Unit 数据库[28]进行物种注释。所有代表序列之间的系统发生关系使用MUSCLE 软件进行序列比对获得[29]。

1.3.2 样本复杂度分析 （Alpha diversity） 使用Qiime 软件和R 软件计算并绘制曲线，以及Alpha多样性指数组间差异分析。

1.3.3 多样本比较分析（Beta diversity） 使用R软件进行PCA 分析和Beta 多样性指数组间差异分析。Metastats 分析使用R 软件进行组间的置换检验，从而得到P 值，并且使用White 等[30]报道方法对P 值进行修正，得到q 值。

2 结果与分析

2.1 注释情况

对4 个品种的蓝莓PCR 产物进行PCR-free文库构建，并对文库双末端进行测序，经过对Reads 拼接得到结果如下：平均每个蓝莓品种样品测得91 177 条原始序列，质控后的蓝莓样品平均得到90 518 条有效数据，质控有效数据量为88 559，质控有效率为97.08%。将所得的序列聚类得到295 个OTUs。并将OTUs 序列与UNITE数据库进行物种注释，结果显示，共有103（34.92%） 个OTU 注释到属水平。进一步计算α多样性与β 多样性，然后进行组间差异比较，从而揭示不同品种蓝莓的群落结构的差异特征。

如图1所示，得到OTUs 后，通过绘制稀疏曲线来判断当前每个蓝莓样品的测序深度是否足以反映该群落样本所包含的微生物多样性。在测序样品中，4 个品种蓝莓果实测序样品的稀释曲线，随着测序深度的增加而逐渐趋于平坦，表明测序数据己获得绝大部分样品信息，己经能够反映蓝莓的微生物群落组成。从稀释曲线的OTU 数量来看，在相同测序深度下，比较不同蓝莓样本中OTU数的多少，从而衡量每个样本的多样性高低，由图1可以看出，蓝金的表面微生物多样性高于其它3种蓝莓的表面微生物多样性。

图1 不同蓝莓品种稀疏曲线（a）和等级分布曲线（b）Fig.1 Rarefaction curve and Rank Abundance curve of different blueberry varieties

蓝莓果实样本中物种的均匀度和丰富度可采用等级分布曲线分析。其中，等级分布曲线的宽度反映蓝莓表面微生物物种的丰富度，物种的丰富度与曲线在X 轴上的跨度相关。而在曲线Y 轴方向，曲线平滑程度反映蓝莓样品中物种均匀程度[31]。综上可知，奥尼尔品种蓝莓果实的表面微生物物种分布的均匀程度和丰富度，高于其它3 个品种微生物的表面微生物均匀程度。

2.2 基于OTU 的花瓣图分析

如图2所示，在北陆表面，共有134 个OTUs，北陆特有39 个OTUs；蓝金表面，共有144个OTUs，蓝金特有56 个OTUs；莱克西表面，共有115 个OTUs，莱克西特有34 个OTUs；奥尼尔表面，共有222 个OTUs，奥尼尔特有70 个OTUs。奥尼尔样本序列所得细菌OTU 数量最多，蓝金其次，莱克西最少，这说明奥尼尔品种含有较丰富的菌群种类，北陆、蓝金、莱克西3 个品种的蓝莓核心菌群组成较相似。奥尼尔与其它3 个品种蓝莓菌群差异较大。

图2 不同蓝莓品种OTU 花瓣图Fig.2 OTU petals of different blueberry varieties

2.3 物种注释概况

通过与数据库UNITE 比对，进行物种注释并分析发现：蓝莓果实样本共检测出295 个OTUs，其中，有208（70.51%）个OTUs 数目可注释到数据库中。表1表明，注释到界水平、门水平、纲水平、目水平、科水平、属水平、种水平的比例分别为70.51%，42.03%，39.66%，38.64%，37.29%，34.92%，23.39%。

表1 物种注释情况Table 1 Species annotation situation

在属水平上，图3显示每个品种蓝莓相对丰度前10 的物种名称及相对丰度，优势物种为平均长度64.01%的枝孢属（Cladosporium）、23.3%的链格孢属（Alternaria），不同品种蓝莓中的主要优势菌群基本相同，而相对丰度差异较大，即北陆和莱克西中枝孢属的相对丰度分别为72.53%和92.2%，而蓝金的枝孢属相对丰度只有41.46%；奥尼尔中枝孢属的相对丰度为49.84%。说明在属水平下，不同品种蓝莓中真菌群落结构组成相同，存在差异的是各物种的组成比例，由图3可知，枝孢属是不同品种蓝莓中的优势菌群。

图3 不同蓝莓品种在属水平上的物种相对丰度柱形图Fig.3 Column chart of relative abundance of different blueberry varieties at the genus level

从图4可以发现，不同样品中优势菌在种水平上有较大差异。北陆和奥尼尔样品间细菌群落组成相似：北陆、蓝金、莱克西、奥尼尔4 种样品中优势种为枝孢菌 （46.87%，25.21%，62.68%，38.39%）、链格孢（24.39%，25.72%，4.55%，38.52%）以及枝孢霉（24.73%，15.6%，28.89%，9.36%）。上述链格孢更多地与采后蓝莓贮藏初期发生暗白色霉变，老后变暗有关，其在蓝莓表面的相对丰度大小也反映其耐贮性[32]。链格孢在莱克西中的相对丰度显著低于其它3 个样本 （P<0.05），北陆和蓝金不显著，奥尼尔显著高于其它3 个品种（P<0.05）。枝孢霉、枝孢菌在各品种间均差异显著（P<0.05）。因此在蓝莓贮藏中，对于该链格孢菌的认识值得深入研究。

图4 不同蓝莓品种在种水平上的物种相对丰度柱形图Fig.4 Column chart of relative abundance of different blueberry varieties at species level

2.4 多样品比较分析（Beta diversity）

根据OTU 的丰度数据，通过绘制属水平上的数据热图，可以将不同的OTU 分块聚类，根据热图中不同颜色的梯度，反映出不同蓝莓样品表面的微生物群落相似性、差异性及物种聚类关系。图5可以直观地显示不同品种样品中微生物的差异。图5a 为OTU 聚类树，左侧为不同品种蓝莓样品聚类树，不同地区的4 种蓝莓可分为3 个聚类：北陆和莱克西聚为一类，蓝金聚为一类，奥尼尔聚为一类，说明不同样品间微生物群落存在一定的差异性，北陆和莱克西群落结构相似度较高，而其它样品两两之间微生物群落差异较大。

主成分分析 （Principal component analysis，PCA）结果（图5b）表明，样品北陆、莱克西距离较近，而北陆、蓝金、奥尼尔，蓝金、莱克西、奥尼尔这两组距离较远，可以推断出北陆和莱克西群落结构相似度较高，而其它样品两两之间微生物群落差异较大。

图5 不同蓝莓品种的多样品比较分析Fig.5 Comparative analysis of multiple samples of different blueberry varieties

2.5 样品复杂度分析（Alpha diversity）

由表2可以看出所有结果Coverage 指数均为1，说明蓝莓样品文库种序列基本都被测出，未被测到的概率极低，测序结果可以反映被测蓝莓样品的真实情况。其中，Shannon 指数可反映蓝莓果实群落多样性和物种的分布情况。Simpson 指数表征群落内物种分布的多样性和均匀度，其指数越大代表不同品种的蓝莓果实微生物群落多样性越低。Chao1 表征蓝莓果实物种总数，ACE 指数可反映不同品种蓝莓果实微生物群落中OTU 数目。由表2可知，根据Simpson 指数显示微生物群落丰度及群落多样性由高至低为莱克西、北陆、奥尼尔、蓝金。根据Shannon 指数，分类总数由高至低为蓝金、奥尼尔、北陆、莱克西。

表2 不同品种蓝莓α 多样性Table 2 α-Diversity of different blueberry varieties

在属水平上，通过α 组间差异分析可初步判断不同品种的蓝莓果实之间的微生物群落的相似性。根据样本所属的类别进行分析和讨论。如图6所示，通过Wilcoxon 秩和检验，发现测得的物种数在蓝金-莱克西、北陆-莱克西、莱克西-奥尼尔两组间有显著差异（P<0.05），其显著性P 值为0.0029，0.0224，0.0387。测得的物种数在蓝金-奥尼尔、北陆-蓝金、北陆-奥尼尔两组间不具有明显的差异（P>0.05），P 值为0.1157，0.1958，0.7333。Shannon指数在蓝金-莱克西、北陆-蓝金、莱克西-奥尼尔等两组间具有明显的差异（P<0.05），显著性P 值为0.0000，0.0001，0.0001。

图6 不同蓝莓品种样品的复杂度分析Fig.6 Analysis of the complexity of different blueberry varieties

3 结论

对不同品种蓝莓进行多样品比较分析发现，北陆和莱克西群落结构相似度较高，且其微生物群落丰度高，群落多样性丰富。通过对比不同样本的物种相对丰度柱形图可以发现，在属水平上的优势物种为枝孢属 （Cladosporium）、链格孢属（Alternaria）；在种水平上的优势物种为枝孢菌（Cladosporium_chasmanthicola）、链格孢（Alternaria_alternata）、枝孢霉（Cladosporium_cladosporioides）。品种差异对蓝莓表面微生物多样性及其群落结构组成具有一定影响，品种差异主要影响枝孢菌、链格孢、枝孢霉等真菌的相对丰度。