高产IAA绿色木霉工程菌株的构建及其应用

张豪， 李哲， 郭凯， 黄艳华， 郝永任

(齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所， 济南 250014)

化肥的滥用导致环境污染问题趋于严重，农药和化肥的残留，向环境释放大量有害物质，污染土壤、水源和食品，对人类健康及生存环境构成极大威胁，因此研制出能够降低化肥用量，符合农业可持续发展的新型肥料十分必要。植物和植物根际土壤存在大量促生菌可使土壤无效营养有效化加强养分利用率，并可产生利于植物生长的代谢产物。

木霉(Trichodermaspp.)是一类重要的多功能丝状真菌，是农业生产中重要的生防菌株和植物促生菌株，广泛分布于土壤中。木霉可以很好地定植在植物根部，随着植物根部的生长而延伸。Harman等[1-2]研究表明,木霉与植物的共生关系，并且通过定植能够促进植物生长。在共生阶段，木霉可以产生一些次级代谢产物，从而对植物的生长产生一些影响，包括增加植物营养物质的吸收，促进植物根的发育，改变植物根际微生物群落等。张量等[3]和Vinale等[4]在木霉菌的代谢产物中还分离纯化出了木霉特有的类植物生长素6-PP (6-n-penty l-6H-py ran-2-one)，发现6-PP不仅能促进植物的生长，同时在帮助植物抵抗病害的方面还有一些积极的作用。木霉还能促进植物对土壤中的营养物质的吸收。接种木霉能增加根系对各种营养物质(铜、磷、铁、锰和钠)的吸收[5]，增加植物与其他生物的营养竞争能力。同时木霉还能产生一些物质，溶解土壤中一些植物无法获得的养分，如Fe3+、Cu2+和Mn4+等[6]。另外，木霉还能增加一些有毒金属的吸收。研究表明，木霉和灌木柳树的结合可以对污染的土壤起到一定的修复[7]。研究发现木霉对多种植物有促生作用。李卫平[8]在研究绿色木霉(T.viride) 对蔬菜苗期病害的影响时发现，接种木霉的黄瓜，生长状况更好。王彗中等[9-10]将哈茨木霉有机肥量使用于马铃薯和白菜，其产量明显提高。Kthiri等[11]在研究木霉菌株包衣对小麦抵抗镰刀菌冠腐病的影响时，也证明了木霉对小麦种子萌发，幼苗的生长和小麦对病原体的防御有积极的作用。Yedidia等[12]用哈茨木霉处理过的黄瓜后，黄瓜的体积也变得更大。

吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)是产生调节植物生长素的信号物质，也是在植物体内普遍存在的生长素物质。它对植物最明显的作用是促进细胞生长，使细胞的体积和重量增加，还具有促进细胞分裂和分化，调节生根等生理功能。IAA并不是植物所特有的，在其他微生物中也发现了IAA[13]。自1977 年科学家发现巴西固氮螺菌能合成IAA 后，更多学者研究发现，土壤中超过50%的细菌可以产生IAA。

木霉代谢产物中含有多种植物生长激素，如：细胞分裂素(CTK)、生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)等，它们可调控植株的很多代谢过程。研究表明，生长素介导的信号通路是调控木霉生防促生能力的主要方式[14]。研究证实了木霉菌可通过产生IAA来促进植株生长，经木霉处理后可以有效地提高植物体内生长素的水平。Gravel等[15]在研究木霉对番茄的生长生产的影响时，发现接种木霉的番茄，其产量要更高，并且进一步发现主要是吲哚乙酸对其产量产生了促进作用。绿木霉(T.virens)代谢产生的IAA，使拟南芥的鲜重增加了62%。另外，从康氏木霉(T.koningii)及哈茨木霉(T.harzianum)的代谢物中分离纯化出来的类植物生长素6-PP (6-n-penty l-6H-py ran-2-one)[3]也能促进小麦胚芽鞘、油菜及番茄幼苗的生长。6-PP不仅能促进植物的生长，还能减少植物病害的发生[16]。

吲哚乙酸的生物合成可通过色氨酸依赖途径和色氨酸非依赖途径进行[17]。 IAA的生物合成主要通过色氨酸依赖型的途径，依据IAA合成的中间产物不同，划分成4条支路：吲哚乙醛肟途径(IAOX)、吲哚丙酮酸途径、色胺途径和吲哚乙酰胺途径[18]。赵还发现了植物中色氨酸转化为IAA的简单两步途径[19]。

近年来，很多与生长素合成相关的重要催化酶系和关键调控基因都被鉴定和克隆。其中色氨酸脱羧酶(L-tryptophan decarboxylase，TDC)是色胺途径中重要的催化酶之一[20]。同时，作为IAA合成的重要前体，色氨酸的合成和含量也是影响IAA产生的关键因素。经分支酸合成色氨酸的代谢途径包含五步反应，由多种催化酶的参与。其中催化最后一步合成的色氨酸合成酶(tryptophan synthase，TRPS)，是异四聚体结构，由trpA和trpB基因编码的α亚基和β亚基组成。在色氨酸代谢工程育种中，色氨酸合成酶是影响色氨酸产率的重要限速酶之一。

利用基因组分析和基因工程技术，调控木霉中重要代谢产物的表达是提高木霉抗逆性、促生能力的有效途径。构建筛选具有高效产生IAA 的木霉工程菌株可为促生生物肥料的研发等提供出发菌株，对促进木霉菌在农业生产中的应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511，由本实验分离鉴定，已保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(保藏号为CGMCC No. 16800)，保藏日期为2018年12月4日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

1.1.2 培养基

培养基均购买于青岛高科园海博生物技术有限公司。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯浸粉6.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，琼脂20.0 g/L。LB培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，琼脂15.0 g/L。

1.1.3 试剂

大肠杆菌DH5α、T4连接酶试剂盒、高保真Taq酶等购自于南京诺唯赞公司；过表达载体构建质粒pBARGPE1-Hygro购自Addgene公司；限制性内切酶KpnI和EcoRI购自NEB公司；氨苄、潮霉素B和溶菌酶购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 绿色木霉TvTRPS和TvTDC基因序列的克隆及表达载体的构建

(1)TvTRPS、TvTDC基因表达盒的克隆。参照真菌基因组提取试剂盒(E.Z.N.A Fungal DNA Kit，美国OMEGA公司)说明书提取绿色木霉Tv-1511基因组DNA。以基因组DNA为模板，扩增TvTRPS基因表达盒的完整序列，扩增引物分别为：TvTRPS-FL-EcoRI-Forward：CGGAATTCATGGCGATTATCAA GCAGA(SEQ ID NO.5)和TvTRPS-FL-KpnI-Reverse：GGGGTACCCTAAAAGCGAAGGTCCCAGC(SEQ ID NO.6)。以基因组DNA为模板，扩增TvTDC基因表达盒的完整序列，扩增引物分别为：TvTDC-FL-EcoRI-For-ward：CGGAATTCATGGATACAGAACAGT TTCG(SEQ ID NO.7)和TvTDC-FL-KpnI-Reverse：GGGGTACCCTACTCCAGCTTCAACTG(SEQ ID NO.8)。利用高保真PCR聚合酶预混液(2×Phanta Master Mix，南京诺唯赞)进行PCR扩增，获得带有酶切连接位点(EcoRI和KpnI)的TvTRPS和TvTDC基因表达盒；对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，利用DNA回收试剂盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit，南京诺唯赞)回收扩增出的DNA片段；将DNA片段连接T载体，测序验证序列的正确性，获得TvTRPS和TvTDC基因表达盒的完整序列。

(2)DNA片段及表达载体双酶切。将回收得到的TvTRPS和TvTDC基因表达盒和载体pBARGPE1用限制性内切酶KpnI和EcoRI(NEB公司)进行双酶切；对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切胶，利用DNA回收试剂盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit，南京诺唯赞生物科技有限公司)回收酶切后的DNA片段和线性化的pBARGPE1质粒。

(3)过表达载体的构建及转化。DNA片段与表达载体的连接采用T4连接酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行，TvTRPS或TvTDC基因表达盒分别与pBARGPE1线性化载体连接，反应体系10 μL。

取50 μL DH5α感受态细胞与10 μL连接体系混匀孵育进行质粒转化，转化后涂布到含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上；37 ℃培养12～20 h后，挑取菌落至含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上，37 ℃，200 r/min培养12～20 h后，送菌落PCR验证。

1.2.2 原生质体制备及过表达工程菌株的构建

(1)原生质体制备。接种绿色木霉Tv-1511于PDA平板，28 ℃培养10 d后，产生大量新鲜分生孢子；用10 mL生理盐水(0.9% NaCl，0.05% Tween-20)洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液；在玻璃纸覆盖的PDA平板上，取200 μL孢子悬液涂布，28 ℃避光培养24 h，使PDA平板上的孢子萌发；配制溶解酶溶液：取0.15 g 溶解酶(Lysing enzyme，Sigma：L1412)溶于20 mL溶液I(1.2 mol/L D-sorbitol, 0.1 mol/L KH2PO4, pH为5.6)，0.2 μmol/L滤膜过滤除菌；取出PDA平板，将长有菌丝的纤维膜取出并反向贴在含有3～4 mL 裂解液的平板上，于28 ℃、100 r/min条件下处理 100 min；在无菌超净台下将平板中的纤维膜取出，确保大部分菌丝体保留在平板中，在此过程中可以用溶液I冲洗纤维膜上残留的菌丝块，利用枪头反复吹吸液体中的菌丝块200次以上，充分释放内部的原生质体；用装有4层纱布的1.5 mL 管过滤上述混合液，保留下层滤液并进行4 ℃离心，2 000 r/min离心10 min，弃上清，保留底部的原生质体。加1 mL溶液I，再次离心，弃上清；加1 mL 4 ℃预冷的溶液II (1 mol/L sorbitol, 50 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L Tris-HCl, pH为7.5)，冰上得到原生质体；用血球计数板观察计数，稀释原生质体至107个/mL。

(2)原生质体转化及突变子筛选。冰上放置15 mL离心管，分别加入200 μL原生质悬浮液、10 μL质粒载体、50 μL PEG溶液(25% PEG600, 50 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L Tris-HCl, pH为7.5); 用枪头混匀，冰上放置20 min；加2 mL PEG溶液，轻轻混匀，常温下放置5 min；加2 mL溶液II，轻轻混匀；加2 mL混合液涂布在覆盖层析纸的含1 mol/L蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28 ℃避光培养24 h；将条形层析纸转导含抗生素的PDA平板上，28 ℃避光培养36 h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2 d。

1.2.3TvTRPS和TvTDC过表达菌株的原生质体融合

利用原生质体融合技术获得同时过表达TvTRPS基因和TvTDC基因的绿色木霉工程菌株，分别制备TvTRPS-OE和TvTDC-OE菌株的原生质体。随后，分别对两种原生质体进行热灭活和紫外灭活。原生质体的灭活率随处理时间的延长和升高，其中TvTRPS-OE原生质体55 ℃热处理25 min灭活率达到100%，TvTDC-OE原生质体经紫外处理20 min后灭活率达到100%。两种灭活液等体积混合，并加入PTC溶液(PTC：60%PEG4000，10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L CaCl2，pH为7.5)促融，35 ℃水浴保温5 min，离心后梯度稀释，混入再生培养基中，28 ℃恒温培养3 d，将平板上长出的单菌落转接PDA平板后保存。

1.2.4TvTRPS、TvTDC基因转录表达水平分析

将3种木霉工程菌的孢子液分别接种于PD液体培养基中，28 ℃，180 r/min培养48 h，通过4层无菌纱布过滤获得无菌的菌丝体。将上述收集的木霉无菌菌丝体，经过液氮充分研磨处理后，用Trizol法提取木霉菌总RNA，并反转录获得cDNA。采用荧光定量PCR检测3种木霉工程菌中TvTRPS基因和TvTDC基因的转录表达水平。

第一，采用“1+1”模式，英文授课。哈工程学生在哈工程完成硕士阶段第一学年课程后，赴法进行第二学年的课程学习和6个月的企业实习，之后回哈工程完成硕士学位论文和答辩，毕业后获法国南特矿业学院的科技硕士和哈工程的硕士学位。学生需向南特支付减免一半的学费，具体费用参照当年学费标准执行[3]。

1.2.5 色氨酸合成酶和色氨酸脱羧酶活性测定

将上述收集的木霉无菌菌丝体，冷冻状态下进行粉碎，加入有机溶剂，离心后，收集上清液，采用液相色谱法检测木霉菌株中的色氨酸合成酶和色氨酸脱羧酶活性。

1.2.6 绿色木霉原始菌株及工程菌株产IAA能力的检测

检测了木霉菌株发酵产生长素IAA的情况。将200 μL木霉原始菌株(Wildtype)和工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的孢子分别接种于PDB液体培养基中，28 ℃,180 r/min培养72 h，通过2层无菌纱布过滤菌丝体后，回收液体发酵液，回收的液体发酵液经10 000 r/min离心后取上清，利用GC-MS检测发酵液中的IAA含量。

1.2.7 绿色木霉原始菌株及工程菌株耐胁迫能力的分析

接种绿色木霉原始菌株及工程菌株于PDA平板，28 ℃培养10 d后，产生大量新鲜分生孢子；用10 mL生理盐水(0.9% NaCl，0.05% Tween)洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液；用30%的甘油悬浮，充分混匀，分装到1.5 mL离心管中，标记好名称和时间，-80 ℃冻存；取一管孢子液进行活菌计数，确定孢子液的浓度。

在PDA平板上活化木霉原始菌株(Wildtype)和突变工程菌(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)，28 ℃避光培养48～72 h，使得原始菌株和突变工程菌木霉长势均一，再使用打孔器制备大小均一的菌块。转移到含有300 mmol/L NaCl的PDA平板中央，进行耐盐实验研究，将不同处理的木霉平板培养一段时间后，分别测量其菌落生长直径。

1.2.8 绿色木霉原始菌株及工程菌株对植物促生能力的分析

供试植物为小麦、黄瓜和椒样薄荷。小麦促生实验：取大小一致、饱满的小麦种子，洗净并吸干水分，浸入木霉原始菌株(Wildtype)或工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的发酵液中24 h，随后将种子置于湿润滤纸上，观察种子萌发及幼苗生长。每个处理设置3个重复。

黄瓜促生实验：挑选饱满一致的黄瓜种子在实验室培育一定时间后，挑选长势一致的幼苗移至水培装置，进行处理。以加入木霉原始菌株(Wildtype)或突变工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的孢子液(终浓度为105)为不同处理组，每个处理设置3个重复。

椒样薄荷促生实验：取在实验室扦插并栽培一段时间的大小一致的椒样薄荷幼苗，移至水培装置，进行处理。以加入木霉原始菌株(Wildtype)或工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的孢子液(终浓度为105)为不同处理组，每个处理设置3个重复。

2 结果

2.1 过表达TvTRPS和TvTDC基因的绿色木霉的工程菌构建及鉴定

从绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511基因组中鉴定出的分别编码色氨酸合成酶和色氨酸脱羧酶的编码基因。通过前期对Tv-1511开展的全基因组测序和精细基因组图谱绘制工作(GenBank Accession No. VCEC00000000；BioProject：PRJNA543939；BioSample：SAMN11791795)，得到了TvTRPS和TvTDC基因及其编码蛋白的详细信息。TvTRPS(NCBI accession number MZ451173)和TvTDC(NCBI accession number MZ451174)基因的序列已分别提交到NCBI GeneBank数据库。TvTRPS的氨基酸序列包含有tryptophan synthase alpha chain (trpA)和tryptophan synthase beta chain (trpB)结构域[图1(a)]，TvTDC的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，包含有pyridoxal-dependent decarboxylase结构域[图1(b)]。

aa为氨基酸图1 TvTRPS和TvTDC蛋白-氨基酸序列结构域示意图Fig.1 Schematic diagram of amino acid sequence and domain of TvTRPS and TvTDC

以木霉基因组为模板，扩增并回收木霉TvTRPS和TvTDC基因，并通过双酶切的方法成功构建了TvTRPS和TvTDC表达载体。利用原生质体，进一步构建了过表达木霉菌株TvTRPS-OE和TvTDC-OE(图2)。利用原生质体融合技术,分别将上述原生质体进行热灭活和紫外灭活，融合后，得到同时过表达TvTRPS基因和TvTDC基因的绿色木霉工程菌株(TvTRPS/TDC-OE)。

采用荧光定量PCR检测TvTRPS、TvTDC基因的转录表达，结果表明，与原始菌株相比，获得的过表达TvTRPS基因(TvTRPS-OE)或者TvTDC基因(TvTDC-OE)的绿色木霉工程菌株，其TvTRPS或者TvTDC基因的转录表达显著提高，而同时过表达TvTRPS基因和TvTDC基因的绿色木霉工程菌株(TvTRPS/TDC-OE)，其TvTRPS和TvTDC基因的转录表达都显著提高(图3)。

2.2 绿色木霉工程菌中色氨酸合成酶和色氨酸脱羧酶活性的变化

TvTRPS是色氨酸合成酶的编码基因，TvTDC是IAA合成途径关键酶色氨酸脱羧酶的编码基因。过表达TvTRPS基因和TvTDC基因后，采用液相色谱法测定了色氨酸合成酶和色氨酸脱羧酶活性。结果表明，与原始菌株相比，过表达TvTRPS基因的绿色木霉工程菌株(TvTRPS-OE)中色氨酸合成酶的活性显著提高，而过表达TvTDC基因的绿色木霉工程菌株(TvTDC-OE)中色氨酸脱羧酶的活性显著提高，TvTRPS/TDC-OE菌株的色氨酸合成酶活性和色氨酸脱羧酶均显著提高(图4)。

primer为引物；terminator为终止子；promotor为启动子图2 TvTRPS和TvTDC表达载体Fig.2 Expression vectors of TvTRPS and TvTDC

图3 木霉工程菌TvTRPS和TvTDC基因转录表达水平Fig.3 Transcriptional expression levels of TvTRPS and TvTDC genes in Trichoderma engineered strains

图4 木霉工程菌色氨酸合成酶和色氨酸脱羧酶的活性测定Fig.4 Determination of tryptophan synthase and tryptophan decarboxylase activity in Trichoderma engineered strains

2.3 过表达TvTRPS和TvTDC基因提高了绿色木霉产IAA的能力

生长素IAA具有多条生物合成途径，色氨酸是其重要的前体物质，而色氨酸脱羧酶(TDC)和色氨酸合成酶(TRPS)是IAA合成途径中相关的重要催化酶系。因此在过表达TvTRPS基因和TvTDC基因后，测定木霉发酵液中IAA的含量变化。结果发现，相比原始菌株(Wildtype)，工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)所产的IAA含量均显著提高，其中TvTRPS/TDC-OE菌株的产IAA的量最高(图5)。

图5 木霉工程菌发酵液中IAA的含量检测Fig.5 Determination of IAA content in fermentation broth of bacterial strains in Trichoderma engineered strains

2.4 过表达TvTRPS和TvTDC基因提高了绿色木霉的抗逆能力

在农业生产中，由于夏天阳光暴晒，以及一些地方盐碱地的特殊地质条件，使得木霉新型肥量，在使用中往往面临着高温和高盐的环境胁迫。在过表达TRPS和TDC基因后，结果发现300 mmol/L NaCl胁迫下，工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的直径平均比原始菌株(Wildtype)显著增加，其中TvTRPS/TDC-OE菌株的直径最大，如图6(a)、图6(b)。在液体培养基中，工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的生物量比原始菌株(Wildtype)显著提高，其中TvTRPS/TDC-OE菌株的生物量最大[图6(c)]。在35 ℃的液体培养环境下，工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的生物量比原始菌株(Wildtype)显著提高，其中TvTRPS/TDC-OE菌株的生物量最大(图7)。

图6 木霉工程菌耐盐能力的分析Fig.6 Salt tolerance analysis of Trichoderma engineered strains

图7 木霉工程菌高温抗性的分析Fig.7 Analysis of high temperature resistance of Trichoderma engineered strains

2.5 过表达TvTRPS和TvTDC基因的绿色木霉工程菌具有更强的植物促生能力

木霉菌属于重要的植物根际促生真菌。在植物根际接种木霉孢子液，可以有效地促进植物的生长。在小麦、黄瓜和椒样薄荷种植中，接种了绿色木霉Tv-1511的孢子液，有效的促进了植物的生长，而且接种了过表达TRPS和TDC基因的工程菌菌株效果更明显。

结果表明，木霉工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)对小麦种子萌发及幼苗生长和黄瓜、椒样薄荷的促生效应明显强于原始菌株(Wildtype)。其中经TvTRPS/TDC-OE发酵液处理的小麦促生效果最明显，如图8所示。

图8 木霉工程菌的促生效果Fig.8 Growth-promotion effects of Trichoderma engineered strains

3 讨论

IAA作为植物生长素，不仅植物可以生产，一些菌类也可以生产。木霉作为代替化肥的新型生物肥料，可以通过分泌一些IAA类似的代谢产物来帮助植物的生长。Contreras-Cornejo等[21]通过气相色谱-质谱在木霉培养液中检测到吲哚类化合物吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-乙醛(IAAld)和吲哚-3-乙醇(IEt)，并用这些物质处理拟南芥，拟南芥表现出生长态势更茂盛。Mir等[22]在芥菜中加入IAA，很好地促进了荠菜的生长。IAA作为生长素，在植物生长和发育的各个方面发挥作用[23-24]。IAA能够调节细胞分裂、生长，能够促进植物根的发育和侧根的生长。在植物生长过程中，还能增加植物光合速率，提高植物生产糖类的能力[25-27]。

IAA的生物合成有依赖色氨酸和非依赖色氨酸两条途径。依据IAA合成的中间产物不同, 依赖色氨酸的生物合成过程通常又划分成4条支路：吲哚乙醛肟途径、吲哚丙酮酸途径、色胺途径和吲哚乙酰胺途径[28]。另外随着生长素合成途径中重要催化酶功能的明确, 也有研究将依赖色氨酸的生长素合成过程分为CYP79B途径、YUCCA(YUC)途径、吲哚乙酰胺途径和吲哚丙酮酸途径[29-30]。从绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511基因组中鉴定出分别编码色氨酸合成酶、色氨酸脱羧酶的编码基因TvTRPS和TvTDC，它们都与色胺途径有关。随后成功构建了TvTRPS和/或TvTDC过表达的绿色木霉工程菌(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)，显著提升了IAA和合成和在发酵液中的含量，增强了绿色木霉的抗逆和促生能力。结果表明TvTDC基因和TvTRPS基因参与了绿色木霉的IAA合成。色胺途径的第一步就是TDC(TRP decarboxylase)催化色氨酸形成色胺，但剩余过程，色胺如何变成IAA的过程还需深入研究[31]。

4 结论

木霉具有代谢途径繁多，代谢产物丰富，且基因的表达转录受到严格控制，木霉作为一类重要的多功能丝状真菌，是工业生产中重要的酶和代谢产物的工程菌。以绿色木霉基因组为模板克隆到了TvTDC基因和TvTRPS基因，并通过PEG介导的原生质体转化法和原生质体融合法构建了TvTDC基因和TvTRPS基因的过表达绿色木霉工程菌株。得出如下结论。

(1)经试验证明，所构建的3种绿色木霉工程菌与原始木霉菌株相比，其生产IAA的能力显著增强，同时具有更强的抗逆和植物促生能力，能够促进木霉菌在农业生产中的应用，因此具有良好的实际应用之价值。

(2)木霉在工业上是重要的产酶菌株，在农业上具有促生作用，也是广泛应用的生防菌，一般用于生产生物肥料和木霉菌剂使用。运用基因组分析和基因工程技术，提高了木霉产IAA的能力，增强了木霉的抗逆和对植物的促生能力，对木霉作为生物肥料的应用起到了积极的作用，同时也证明了运用基因组分析和基因工程技术来促进木霉的生产应用是具有可行性的。

随着木霉的研究深入和基因技术的发展，木霉作为优秀的生产工程菌，运用基因技术对木霉基因进行不断地挖掘，进一步提高木霉在促生、抗逆和生防方面的生产应用，仍具有重要的意义。