长链非编码RNA DLX6-AS1与微小RNA-346在糖尿病足72例血清中的表达及其临床意义

李杰玉，林玉玲，李曾一，刘琳，金文波

糖尿病足溃疡是糖尿病主要并发症之一，神经与血管病变、感染等可促进糖尿病足溃疡的发生，其中炎症反应与细菌感染是造成糖尿病足溃疡病人截肢甚至死亡的重要原因［1-4］。但糖尿病足溃疡细菌感染及其与血管病变的相关性尚未完全阐明。长链非编码RNA（lncRNA）DLX6-AS1在糖尿病肾病中呈高表达，而微小RNA（miR）-346 表达下调，DLX6-AS1 可能靶向调控miR-346 表达从而参与糖尿病肾病发生及发展过程［5］。研究表明miR-346 在高糖诱导的足细胞分化中发挥重要调控作用［6］。但DLX6-AS1、miR-346 在糖尿病足溃疡中的表达水平尚未可知。本研究通过检测糖尿病足溃疡病人血清中DLX6-AS1、miR-346 的表达水平，分析其与炎性因子水平的相关性，初步探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2017 年5 月至2018 年12 月南阳市中心医院收治的72 例糖尿病足病人为糖尿病足组，所有病人均符合糖尿病足的诊断标准［7］。糖尿病足组病人年龄（65±6）岁，范围为50～70岁；病程（13.25±7.65）年；男40 例，女32 例。根据Wagner 分级标准［8］将糖尿病足病人分为1 级14 例、2 级14 例、3 级14 例、4 级16 例、5 级14 例。选取同期该院收治的60 例2 型糖尿病病人为糖尿病组，所有病人均符合2 型糖尿病诊断标准［9］，且未达到糖尿病足的诊断标准，其中男35 例，女25 例；年龄（66±6）岁，范围为52～71岁；病程（14.13±6.12）年。选取同期于该院进行健康体检的健康志愿者55例作为对照组，其中男28 例，女27 例；年龄（67±7）岁，范围为51～76 岁。各组研究对象年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：糖尿病足病人为第1 次发生足部溃疡；糖尿病组与对照组受检者均无足部溃疡；无心功能障碍者；无肝、肾功能不全者。排除标准：外周血管病变病人；合并其他内分泌系统疾病者；合并恶性肿瘤病人。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，所有病人知情且签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 采集血液样本 所有研究对象均于入组次日清晨抽取空腹静脉血5 mL，4 ℃条件下经3 000 r/min 离心6 min，吸取血清，置于-20 ℃冰箱内保存待测。

1.2.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测细胞中DLX6-AS1、miR-346 的表达水平 取冻存血清样本，采用Trizol 法提取血清中总RNA。参照逆转录试剂盒将RNA 逆转录为互补DNA（cDNA）。以cDNA 为模板进行qRT-PCR 反应，反应条件：95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共循环40 次。DLX6-AS1 以GAPDH 为内参，miR-346 以U6 为内参，采用2-ΔΔCt法计算DLX6-AS1、miR-346 相对表达量。Trizol、逆转录与荧光定量PCR试剂盒均购自美国Thermo Fisher公司。

1.2.3 酶联免疫吸附测定（ELISA）检测炎性因子水平 采用ELISA检测血清炎性因子血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、成纤维细胞生长因子2（FGF2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，严格按照试剂盒说明书进行操作，Multiskan MK3 酶标仪购自美国Thermo Fisher公司。采用电化学发光法检测血清中白细胞介素-6（IL-6）水平，Cobas e601电化学发光免疫分析仪及检测试剂盒购自美国Roche 公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 观察指标 检测所有研究对象收缩压、舒张压、空腹血糖、糖化血红蛋白（HbA1c），检测仪器购自美国Bio-Rad公司。

1.3 统计学方法采用统计学软件SPSS 21.0 进行分析。符合正态分布的计量资料以± s表示，两组间比较采用两独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料采用χ2检验；采用Pearson相关性分析检验变量间的相关性；采用logistic 回归分析研究影响糖尿病足发生的相关因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组研究对象一般资料比较三组受检者收缩压、舒张压、HbA1c比较差异无统计学意义（P＞0.05），糖尿病组、糖尿病足组病人空腹血糖、VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 水平高于对照组（P＜0.05），糖尿病组与糖尿病足组VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 健康者55例与糖尿病132例一般资料比较/± s

注：HbA1c为糖化血红蛋白，VCAM-1为血管细胞黏附分子-1，FGF2为成纤维细胞生长因子2，TNF-α 为肿瘤坏死因子-α，IL-6为白细胞介素-6。①与对照组相比，P＜0.05。②与糖尿病组相比，P＜0.05。

临床指标收缩压/mm Hg舒张压/mm Hg HbA1c/%空腹血糖/（mmol/L）VCAM-1/（μg/L）FGF2/（ng/L）TNF-α/（ng/L）IL-6/（ng/L）对照组（n=55）124.35±10.32 79.51±14.65 5.23±0.36 4.85±0.96 136.58±56.32 8.56±1.36 6.57±1.35 3.25±1.03糖尿病组（n=60）126.57±16.57 80.13±15.24 5.42±1.58 8.21±2.54①653.24±175.45①12.65±3.71①16.15±4.16①4.59±1.13①糖尿病足组（n=72）127.59±18.46 81.11±12.57 5.44±1.23 8.42±2.56①865.42±132.26①②17.68±5.13①②21.74±6.52①②15.68±3.21①②F值0.66 0.21 0.56 48.29 484.29 87.39 160.42 654.14 P值0.516 0.811 0.575＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 各组研究对象血清中lncRNA DLX6-AS1 与miR-346 的表达比较与对照组相比，糖尿病组与糖尿病足组病人血清中DLX6-AS1 的表达水平显著升高（P＜0.05），miR-346 的表达水平显著降低（P＜0.05），糖尿病组与糖尿病足组血清中DLX6-AS1、miR-346 的表达水平相比差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 健康者55例与糖尿病132例血清中DLX6-AS1与miR-346的表达比较/± s

表2 健康者55例与糖尿病132例血清中DLX6-AS1与miR-346的表达比较/± s

注：①与对照组相比，P＜0.05。②与糖尿病组相比，P＜0.05。

组别对照组糖尿病组糖尿病足组F值P值例数55 60 72 DLX6-AS1 1.01±0.13 2.16±0.25①3.20±1.03①②172.54＜0.001 miR-346 1.00±0.16 0.73±0.11①0.41±0.08①②397.60＜0.001

2.3 DLX6-AS1 与miR-346 在不同Wagner 分级糖尿病足组病人血清中的表达比较与Wagner分级1级糖尿病足病人相比，2～5级病人血清DLX6-AS1的表达水平显著升高（P＜0.05），miR-346 的表达水平显著降低（P＜0.05），见表3。

2.4 糖尿病足组病人血清中DLX6-AS1、miR-346的表达与炎性因子水平的相关性分析Pearson 相关性分析显示糖尿病足病人血清中DLX6-AS1 的表达 与VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 呈 正 相 关（P＜0.05），miR-346 与FGF2、TNF-α、IL-6 呈负相关（P＜0.05），见表4。

表3 DLX6-AS1与miR-346在不同Wagner分级糖尿病足72例血清中的表达比较/± s

表3 DLX6-AS1与miR-346在不同Wagner分级糖尿病足72例血清中的表达比较/± s

注：①与1级相比，P＜0.05。

Wagner分级1级2级3级4级5级F值P值例数14 14 14 16 14 DLX6-AS1 1.23±0.18 2.11±0.15 2.58±0.16 3.01±0.16 3.31±0.37①198.54＜0.001 miR-346 0.98±0.13 0.65±0.10 0.63±0.11 0.53±0.13 0.35±0.09①57.59＜0.001

表4 糖尿病足72例血清中DLX6-AS1、miR-346的表达与炎性因子水平的Pearson相关性分析结果

2.5 影响糖尿病足发生的多因素分析采用logistic 回归分析对影响糖尿病足发生的相关因素进行分析，结果显示血清中DLX6-AS1 表达量升高与miR-346 表达量是影响糖尿病足发生的独立危险因素（P＜0.05），见表5。

表5 影响糖尿病足发生的多因素logistic回归分析结果

3 讨论

lncRNA 可通过调控下游miRNA 表达从而参与多种炎性反应疾病发生过程，研究表明lncRNA 在糖尿病足病人中异常表达并可能参与该疾病发生及发展过程［10-11］。但lncRNA 在糖尿病足发生过程中的调控机制尚未阐明，因而本研究积极寻找新型lncRNA，初步分析其在糖尿病足病人中的表达，为深入了解糖尿病足的病理生理机制提供新方向。

DLX6-AS1 在大肠癌、膀胱癌、宫颈癌等肿瘤中呈高表达并可促进肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭［12-14］。但DLX6-AS1 在糖尿病足中的表达尚未可知。本研究结果显示糖尿病足病人血清中DLX6-AS1 的表达水平显著升高，随着Wagner 分级的增加DLX6-AS1的表达水平明显升高，提示DLX6-AS1 表达量升高可能促进糖尿病足发生及发展。研究表明炎性因子VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 在糖尿病足病人中的水平升高，并可促进其发展进程［15-16］。与上述研究结果相似，本研究结果显示糖尿病足病人血清中炎性因子VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 水平明显高于糖尿病组病人，提示炎性因子VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 水平升高可加重糖尿病足的严重程度。本研究进一步分析显示DLX6-AS1 表达量与炎性因子VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 呈正相关，说明随着DLX6-AS1 表达量的升高可明显促进糖尿病足病人体内炎症反应的发生。提示DLX6-AS1 可能在糖尿病足发生过程中发挥重要调控作用。

miR-346 在脓毒症病人中表达下调，并可参与脓毒症发生及发展过程［17-18］。有研究表明miR-346还可调节机体免疫反应［19］。本研究结果显示miR-346 在糖尿病足病人血清中的表达下调，随着Wagner 分级的增加miR-346 的表达量明显降低，其低表达量与炎性因子FGF2、TNF-α、IL-6 呈负相关，提示miR-346 表达量降低可能促进糖尿病足的发生及发展。同时本研究采用logistic 回归分析对影响糖尿病足发生的相关因素进行分析，结果显示血清中DLX6-AS1 与miR-346 表达量是影响糖尿病足发生的独立危险因素，提示血清中DLX6-AS1 表达水平升高与miR-346表达水平降低可增加糖尿病足的发生风险。

综上所述，糖尿病足病人血清中DLX6-AS1 表达升高，miR-346 表达降低，二者表达量变化与糖尿病足进展密切相关，还与糖尿病足炎症反应程度有关，可能作为临床诊断糖尿病足的有效标志物，还可为揭示糖尿病足发病机制提供新思路。但本研究样本量较小，后续还须扩大样本量进一步证实。