复方芪参提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移侵袭和周期的影响

瘢痕疙瘩是一种组织在创伤或感染后过度修复、纤维化的良性肿瘤，其病理进展与瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、迁移、侵袭的调控异常有关

。有研究表明，复方芪参提取物能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，其作用机制可能与抑制Smad2连接区和Smad3连接区磷酸化有关

。复方芪参提取物可能通过调控TGF-β/Smad信号传导通路抑制兔耳瘢痕增生

。复方芪参提取物通过抑制肝纤维化和PAI-1mRNA的表达而阻碍肝细胞癌发展

。但复方芪参提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移侵袭和细胞周期的影响鲜有研究。故本次对此进行研究。

拌和站的混合料拌和能力应与混合料摊铺速度相匹配，在沥青混合料摊铺时，应保证摊铺机前始终有4～5辆自卸卡车等待卸料。混合料在运输过程中，为防止温度下降过快，影响长大纵坡试验段路面摊铺、压实质量，最好在自卸式卡车上覆盖一层油毡布，同时尽可能加快车辆在运输时的速度，以减少混合料热量的散发。

1 材料和方法

1.1 材料：瘢痕疙瘩成纤维细胞（笔者医院外科手术切除的瘢痕组织离体标本）。

1.2 药物和主要试剂：中药材丹参（安徽省亳州市药材市场）；DMEM培养基（Gibco，美国）；1%青霉素链霉素抗生素（Thermo Fisher，美国）；胰蛋白酶和10%胎牛血清（Thermo Fisher，美国）；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗（艾美捷科技，武汉）；RIPA裂解液、PVDF膜（ThermoFisher，美国）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，上海）；CO

细胞培养箱（Thermo，美国）；MTT试剂盒（生物工程股份有限公司，上海）；兔抗人细胞周期蛋白1（Cyclin D1）抗体、VEGF抗体、MMP9抗体、p53蛋白抗体（Santa Cruz，美国）；BIO-RAD Powerpac Universal通用型电泳仪（伯乐，美国）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及分组：将瘢痕疙瘩成纤维细胞转移至5 ml EP管中，并加入1 ml含10%胎牛血清的DMEM培养液，将两者混匀，并放于离心机中进行离心（1 000 rpm，5 min），弃掉上清液，对细胞沉淀进行收集，之后加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM培养液并吹打混匀，以适当密度接种于新的培养皿中，放置于培养箱中（37℃、5% CO

）进行孵育。待细胞密度到达80%以上时，进行传代，当细胞密度达到80%以上时，弃去旧培养基，之后用3 ml的PBS缓冲液冲洗2～3次，将剩余的PBS缓冲溶液吸去，再加入1 ml的胰酶在37℃培养箱中进行消化，待细胞变圆，相互分离时，立即加入新鲜培养液2 ml终止消化，吹打成细胞悬液并吸取到5 ml EP管中，将其放于离心机中进行离心（1 000 rpm，5 min），倒掉上清液，对细胞沉淀进行收集，加入新鲜培养液2 ml配制成细胞悬液，吹打混匀以适当密度接种至新的培养皿中，之后对培养皿外表面进行消毒，放入培养箱中进行孵育。后续将瘢痕疙瘩成纤维细胞培养于复方芪参提取物的DMEM培养基中，以维持耐药性。将瘢痕疙瘩成纤维细胞分为对照组、低浓度组，中浓度组及高浓度组

。

1.3.2 MTT检测瘢痕疙瘩成纤维细胞活力：取对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞，将各组瘢痕疙瘩成纤维细胞接种于96孔板中，每孔加入200 μl的细胞悬液，细胞贴壁后，加入复方芪参提取物进行处理。将复方芪参提取物设为3个不同浓度(10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L)，与细胞进行共培养48 h后，每孔加入20 μl的MTT试剂，置于恒温培养箱中继续培养4 h，之后使用酶标仪检测波长为490 nm处的吸光度（OD）值

。细胞增殖抑制率（%）=（OD

-OD

）/OD

×100%。

2.4 复方芪参提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞VEGF、MMP9、Cyclin D1、p53蛋白表达的影响：Western blot结果可知，与对照组相比，低、中及高浓度组瘢痕疙瘩成纤维细胞VEGF、MMP9、Cyclin D1、p53蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义（

＜0.05）。见图3，表4。

2.3 复方芪参提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞周期的影响：与对照组相比，低、中及高浓度组在G0/G1期的阻滞率明显上升，S期的阻滞率明显下降，G2/M期的阻滞率上升，差异均有统计学意义（

＜0.05）。由于G0/G1期细胞占比较高，因此复方芪参提取物主要通过增加G0/G1期细胞阻滞抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的周期进展。见图2，表3。

1.3.5 瘢痕疙瘩成纤维细胞周期进程检测：将瘢痕疙瘩成纤维细胞接种到12孔板中，细胞接种密度为1.5×10

个细胞/孔，细胞培养24 h后，分为对照组、低浓度组，中浓度组及高浓度组，每个组设置3个复孔，使用乙醇（75%）固定瘢痕疙瘩成纤维细胞，用RNA酶进行处理，用10 μg碘化丙啶进行染色。为了进行S相分析，使用50 μM的溴脱氧尿苷培养细胞3 h。固定后，对盐酸处理覆盖物，并进行免疫荧光处理。严格按照试剂盒说明书进行操作，然后检测各组HepG2.2.15细胞的周期阻滞率

。

式中：Si为某污染物的污染指数；Ci为某污染物的实测浓度，mg/L；C0为某污染物的评价标准值，mg/L.

1.3.4 Western Blot检测复方芪参提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞中VEGF、MMP9、Cyclin D1、p53蛋白表达的影响：将对数生长期细胞以2×10

个/瓶接种于培养皿中，培养至传代时，使用预冷的PBS洗涤3次，向每组加入150 μl的RIPA裂解液，对细胞进行均匀吹打，放置于4℃摇床上裂解15 min，之后将细胞刮下，经超声振荡离心后提取总蛋白，用BCA蛋白测定试剂盒进行定量，对上样缓冲液均匀混合后，取40 μg蛋白进行上样后，进行SDS-PAGE电泳（1.5 h，250 mA），于室温下封闭1 h。分别加入抗体VEGF、MMP9、Cyclin D1、p53（1:1 000），经TBST冲洗3次后，加入HRP标记的羊抗兔1gG二抗（1:2 000），室温下孵育1.5 h，进行显影。用目的蛋白条带和内参吸光度（A）值的比值表示目的蛋白水平

。

日本雕塑家新宫(SusumuShingu)是一位自上世纪70年代以来一直活跃在动态雕 塑领域的艺术家，他的作品大都从大自然中来。他是一位仍然坚持用最简单、 原始的一套动态艺术原理制作动态雕塑的艺术家。并且，与考尔德雕塑的强大自然动力形式不同的是新宫晋的动态雕塑中所体现出的“自然哲思”（见图6）。

2 结果

2.2 复方芪参提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移和侵袭的影响：Transwell检测可知，与对照组比较，随着复方芪参提取物浓度的增加，低、中及高浓度组细胞迁移数逐渐降低，细胞侵袭数降低，差异均有统计学意义（

＜0.05）。见图1、表2。

2.1 复方芪参提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响：见表1，MTT检测结果可知，复方芪参提取物处理瘢痕疙瘩成纤维细胞48 h后，随着复方芪参提取物浓度的增加，细胞的增殖抑制率逐渐升高，差异有统计学意义（

＜0.05），表明复方芪参提取物能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。

3.借鉴存款保险制度。退押准备金制度只能保证共享租赁企业正常运营时的退押顺利。共享租赁公司作为新型经济主体，本身就存在较大风险，打去年以来，已有多家共享单车企业倒闭。倒闭公司的押金退回风险已经发生。因此为避免公司倒闭带来的押金风险，我们依然可以借鉴银行业的存款保险制度，由共享单车企业为押金投保，一旦发生公司倒闭，由保险公司分担风险。

1.3.3 Transwell检测瘢痕疙瘩成纤维细胞侵袭能力：将24孔的Transwell室上腔室底部预涂基质，将1×10

个瘢痕疙瘩成纤维细胞接种于上室，用无血清DMEM培养基培养。将细胞培养液与含15%胎牛血清的新鲜DMEM培养液1:1混合加入下腔室。细胞培养24 h后，用10%甲醇固定细胞，用0.1%结晶紫染色。最后，在显微镜下观察染色后的细胞

。

3 讨论

瘢痕疙瘩是由皮肤组织受损后异常愈合引起的，主要是因为成纤维细胞异常增殖从而导致细胞胶原分泌量增加，进而使得结缔组织增生或变形为瘢痕，瘢痕疙瘩形成已经严重影响到患者的身心健康，目前，在临床上主要使用手术、药物以及激光等治疗技术，但是治疗效果不理想，复发率高

。研究表明促进成纤维细胞发生调亡，抑制细胞增殖，可以有效改善瘢痕疙瘩

。因而根据瘢痕疙瘩的分子机制，寻找出治疗靶点来提高治疗效果及降低复发率至关重要。

2.4.3 不同年龄的医务人员院感知识认知正确率比较分析 按年龄段分析医务人员院感知识认知正确率发现，30岁以上的医务人员对问卷的总体认知正确率要显著高于30岁以下的医务人员，差异有统计学意义（P＜0.05）。逐一对问卷的7个方面进行分析，可知不同年龄段的医务人员在传染病认知、院感传播知识认知、治疗过程防护认知、操作相关知识认知等正确率上差异均有统计学意义（P＜0.05），且31～50岁年龄段的医务人员普遍具有较高的认知正确率，见表3。

复方芪参提取物属于中药复方制剂，由中药丹参以及黄芪所提取的有效成分黄芪总苷、黄芪多糖和丹酚酸按一定的比例组成。丹参具有化瘀散结的功效，黄芪具有敛疮生肌功效，两者均能够治疗肝纤维化、病理性瘢痕等疾病

。本课题通过体外实验表明，复方芪参提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞作用48 h后，随着复方芪参提取物浓度的增加，低、中及高浓度组细胞的增殖抑制率逐渐升高，细胞迁移数以及侵袭数逐渐降低。表明复方芪参提取物能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，削弱瘢痕疙瘩成纤维细胞发生侵袭与转移的潜能。本实验结果与文献报道结果一致

。

病理性瘢痕中，成纤维细胞过度增殖是导致瘢痕形成的主要环节，多种凋亡抑制基因与促凋亡基因参与成纤维细胞的增殖和凋亡过程，Bax和Bcl-2均作为Bcl-2家族成员，Bax为促凋亡蛋白，Bcl-2能够抑制凋亡，两者相互作用从而影响细胞凋亡过程

。在病理性瘢痕中，细胞凋亡基因受到抑制，细胞调控周期变短，促进细胞增生，促进瘢痕形成

。研究表明Cyclin D1是G1期细胞增殖信号的关键蛋白，抑制增生瘢痕中Cyclin D1的表达并可通过与细胞周期依赖蛋白激酶（CDK4/6）结合形成复合物从而阻滞细胞周期，促进细胞增殖

。本实验研究，与对照组相比，低、中及高浓度组在G0/G1期的阻滞率明显上升，S期的阻滞率明显下降，G2/M期的阻滞率上升，瘢痕疙瘩成纤维细胞相关蛋白表达水平明显下降。本实验结果与文献报道结果一致

。

综上，复方芪参提取物能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，降低瘢痕疙瘩成纤维细胞发生侵袭与转移的潜能。

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