UPLC-MS/MS检测女金丸中9种青霉素类抗生素残留*

李应才，黄合琤，董丽荣，杨 野

(1.昆明市食品药品检验所，云南 昆明 650032；2.昆明理工大学，云南 昆明 650500)

女金丸（水蜜丸）是由当归等23味中药，粉碎成细粉，过筛，混均，每100 g粉末用炼蜜35～50 g作为黏合剂，加适量水制成的固体制剂[1]。在蜜蜂养殖中，蜂农为了防病治病，会使用氯霉素、青霉素等各种抗生素，从而残留在蜂蜜中[2-5]。青霉素类抗生素具有较多的不良反应，包括过敏反应、皮疹、白细胞数目减少、心率增加、恶心、呕吐、血尿等，会累及多个系统及器官，使患者的器官功能受到损害，更有甚者会威胁生命安全[6-7]。目前有文献报道蜂蜜中抗生素的检测[8-11]，但中药丸剂中抗生素的检测少有报道。中药丸剂的制备，如果使用了抗生素残留超标的蜂蜜，将带入制剂中，对人体产生伤害。本试验以女金丸（水蜜丸）为研究对象，采用超高效液相色谱-串联质谱法[12-24]，建立了一种快速、有效检测女金丸中9种青霉素类抗生素残留的检测方法，为中药丸剂中抗生素残留的检验研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 AB SCIE 5500+QTRAP质谱仪，配ESI离子源（美国应用生物系统公司）；超高效液相色谱仪（SHIMADZU LC40）；AL104（万分之一）电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；MS105DU（十万分之一）微量分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；Milli-Q 7015超纯水制备仪（MERCK MILLIPORE默克密理博）；KQ5200DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂试药 对照品9种青霉素混标（批号21020687）来源于北京坛墨质检科技有限公司；色谱纯乙腈购于Thermo Fisher公司，色谱纯甲酸购于国药集团化学试剂有限公司。女金丸为网络购买样品，共30批次。

2 实验方法

2.1 实验条件

2.1.1 液相色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液-乙腈；流速：0.2 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。按照表1进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序

2.1.2 质谱条件 采用SCIEX 5500+QTRAP质谱系统，电喷雾离子源（ESI源），多反应监测模式，离子源温度为550℃，正离子模式扫描，离子源电压为5.5 kv，喷雾气（Gas1）55 Psi，辅助加热气（Gas2）55 Psi，气帘气30 Psi。优化得到各药物的质谱参数见表2。

表2 各药物质谱参数

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取上述对照品适量，置于10 mL量瓶中，加水使其溶解并定容至刻度，摇匀，得九种青霉素混合对照品储备液。

精密量取上述混合对照品储备液适量，用20%乙腈溶液稀释至需要浓度，得9种青霉素混合对照品工作溶液。

2.2.2 供试品溶液 取供试品适量，研细，取约2 g，精密称定，置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入10 mL水，涡旋震荡10 min。精密加入乙腈10 mL，涡旋混合1 min，再加入4.0 g无水硫酸镁、1.0 g氯化钠混合粉末，立即摇散，置振荡器上剧烈振荡3 min，离心（5 000 r/min）5 min。精密吸取5 mL上层清液，置于预先装有100 mg C18、150 mg N-丙基乙二胺（PSA）、100 mg石墨化炭黑（GCB）的离心管中，涡旋2 min，离心（5 000 r/min）5 min。精密吸取上清液2 mL，置氮吹仪上于40℃水浴吹干，精密加入20%乙腈溶液1.0 mL，涡旋混匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 线性范围、检测限及定量限考察 精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，用20%乙腈溶液稀释成系列浓度的混合对照品工作溶液，按“2.1”项条件测定。以各对照品质量浓度（X，ng·mL-1）为横坐标，以定量离子对峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归计算，结果色谱峰面积与其质量浓度在一定的范围内具有良好的线性关系，r均大于0.999。精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，逐级稀释后按“2.1”项条件测定，以离子对信噪比大于等于3考察其检测限，以离子对信噪比大于等于10考察其定量限。结果见表3。

表3 各药物成分线性关系、检测限及定量限

2.4 精密度、重复性、稳定性实验 精密吸取同一混合对照品工作溶液，按“2.1”项条件测定，连续进样6次，其峰面积的RSD均小于4%，表明仪器精密度良好。精密称取6份阴性样品，每份约2.0 g，加对照品溶液，添加量为10.0 ng，按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项条件分别进样测定，计算各添加药物成分的含量，其平均含量RSD均小于4%，表明该方法重复性好。取同一份供试品溶液，在室温下放置 0、2、4、6、8、12 h 后，按“2.1”项条件分别进样测定，记录各药物成分峰面积并计算其RSD值，均小于4%，表明供试品溶液在室温下放置12 h内稳定。结果见表4。

表4 各药物成分的精密度、重复性、稳定性结果（n=6）

2.5 准确度试验 精密称取6份阴性样品，每份约2.0 g，加对照品溶液，添加量为 10.0 ng，按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项条件分别进样测定。结果见表5。

表5 各药物成分加样回收率试验结果（n=6）

续表5

2.6 实际样品的检测 利用建立的方法，对30批样品进行检测，结果在30批样品中，有1批样品检出双氯西林，含量为0.193 mg·kg-1，其他样品均未检出。对照品溶液（A）和阳性供试品溶液（B）多反应监测（MRM）色谱图见图1。

图1 对照品溶液（A）和阳性供试品溶液（B）多反应监测（MRM）色谱图

3 讨论

3.1 色谱条件的优化 本试验比较了流动相体积分数为0.1%的甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%的甲酸水溶液-甲醇溶液、0.1%的甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液及0.1%的甲酸水溶液-乙腈溶液对目标物的分离效果。结果表明，流动相体积分数为0.1%的甲酸水溶液-乙腈溶液时，目标物离子化效率高，色谱峰形好。

3.2 前处理方法的优化 本方法比较了水、甲醇和乙腈，作为提取溶剂进行直接提取的提取效率，结果用水提取，乙腈萃取提取效率最好，但由于样品基质复杂，基质干扰效应明显，难于满足回收率要求。本文选择了QUECHERS盐包萃取净化法，通过优化PSA、GCB和C18用量比例，达到了最优净化效果。

3.3 中药丸剂抗生素残留检测的思考 中药丸剂抗生素残留，除了人为添加外，主要由蜂蜜残留而引入。目前蜂蜜中抗生素的检测已有报道。由于蜂蜜基质相对中药更单一，对实验的基质干扰更小，建议加强对中药丸剂辅料蜂蜜的抗生素残留进行检测控制。

4 小结

本试验建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时检测中药丸剂中9种青霉素类抗生素残留的分析方法。该方法具备灵敏度高、重复性好、分析时间短、取样量小等优点，可为检测中药丸剂中抗生素残留提供参考。