维生素D对小鼠结核感染后获得性免疫的影响

翁芳芳 余建平 徐凯进

结核病是一种严重威胁人类健康的传染病。我国是结核病大国，是全球22个结核病高负担国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一［1］。文献报道维生素D的缺乏与结核病的发生可能有所关联［2］，维生素D补充剂可在高危人群中帮助人们抵抗结核病，其机制可能与先天免疫和获得性细胞的动态变化相关［3］。本研究探讨维生素D对小鼠结核感染获得性免疫细胞的影响，并通过检测T细胞因子水平探究其机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 （1）BALB/c小鼠：5~6周龄SPF级BALB/c雄性小鼠，共60只，由本院实验动物中心提供和饲养。所涉及的动物实验操作由本院实验动物伦理委员会批准。（2）H37Ra标准菌株：该菌株购于上海康朗生物科技有限公司。菌株在罗氏培养基固定培养，其培养条件为37℃，恒温保湿。培养20 d后，无菌刮取培养基上生长旺盛呈菜花样的菌落进行研磨，用0.9%氯化纳溶液配制成20 mL菌悬液，其浓度为5×106CFU/mL［4］。（3）药品与试剂：Vitamin D3（740551，1 mL），Mouse IFN-γ ELISA Kit（RAB0225），Mouse IL-4 ELISA Kit（RAB0300），Mouse IL-17 ELISA Kit（RAB0263）购于sigma公司，Mouse TGF-β 1 ELISA KIT（SEKM-0035）购于Solarbio公司，PE Anti-CD3（ab22268，50 test），APC Anti-CD8（ab237368，100ul），FITC Anti-CD4（ab59474，50 test）购于Abcam公司。（4）仪器设备：BD FACS Calibur流式细胞仪（美国），MD pectraMax190酶标仪（美国）。

1.2 实验方法 （1）小鼠分组及饲养条件：60只5~6周龄雄性小鼠于SPF级鼠房饲养，饲养条件为18~28℃，日温差≤3℃，相对湿度40%~70%。适应性饲养1周后，随机分为3组，分别为对照组、感染组和维生素D干预组，每组各20只。（2）结核感染及干预方式：感染组和维生素D干预组的小鼠通过尾静脉注射H37Ra菌株，注射剂量为1.0×106CFU/0.2 mL，对照组注射等量0.9%氯化纳溶液［4］。维生素D干预组当天肌肉注射维生素D，7 μg/kg，1次/3 d，连续8周，对照组和感染组注射等量0.9%氯化纳溶液。按照小鼠建模及实验原则，进行H37Ra结核菌株培养的明场图，以确定菌株培养的准确性；各组小鼠接种结核菌株后，解剖小鼠的肺组织病理宏观图及微观图，以确定造模的成功。（3）流式细胞检测：小鼠眼眶取血后，进行红细胞裂解，1,500 r/min离心5 min，PBS重悬外周血单核细胞（peripheral Mononuclear Blood Cell，PBMC），将配好的CD3、CD4、CD8混合抗体加入1.0×106细胞中，4℃避光孵育30 min，2 mL PBS清洗后，流式细胞术检测细胞亚型及细胞比例［5］。（4）ELISA检测血浆细胞因子：使用小鼠IFN-γ、IL-14 、IL-17及TGF-β ELISA检测试剂盒，检测血清样本中 IFN-γ、IL-14 、IL-17及TGF-β含量水平，每组设置3个复孔，操作步骤严格按照说明书进行［5］。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，计数资料以（n）表示，采用检验；实验独立重复3次，采用双尾独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 维生素D干预对小鼠感染后主要脏器质量的影响 感染组与维生素D干预组小鼠脾脏、肺、肾脏、肝脏质量均与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），且感染组与维生素D干预组各器官质量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 维生素D对结核感染小鼠主要脏器质量的影响［g，（±s）］

表1 维生素D对结核感染小鼠主要脏器质量的影响［g，（±s）］

对照组 感染组 维生素D干预组体重 22.21±2.11 22.19±3.2 21.97±1.97脾脏 0.0061±0.0001 0.0060±0.0011 0.0060±0.0009肾脏 0.011±0.001 0.012±0.007 0.012±0.001肺0.0053±0.0005 0.0058±0.0015 0.0054±0.0007肝脏 0.042±0.0035 0.041±0.0025 0.041±0.0027

2.2 维生素D对结核感染小鼠外周血T细胞亚群影响 与对照组比较，感染组和维生素D干预组CD3+T细胞比例增加（P＜0.01），CD4+T细胞比例增加（P＜0.001），CD8+T细胞降低（P＜0.01），CD4+/CD8+T细胞比例升高（P＜0.01），维生素D干预组CD4+/CD8+T细胞比例与感染组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 维生素D对结核感染小鼠T细胞亚群的影响（±s）

表2 维生素D对结核感染小鼠T细胞亚群的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01，**P＜0.001；与感染组比较，#P＜0.05

指标 对照组 感染组 维生素D干预组CD3+ T 54.3±1.69 64.27±1.69* 65.31±2.17*CD4+ T 40.33±1.24 55.9±2.82** 56.3±1.72**CD8+ T 14.2±2.82 11.1±1.41* 10.9±3.21*CD4+ /CD8+ T 3.11±0.18 5.04±0.31* 5.13±0.26*#

2.3 维生素D对结核感染小鼠外周血Th1、Th2、Th17及Treg细胞因子的影响 与对照组比较，维生素D干预组和感染组小鼠均出现IFN-γ、IL-17及TGF-β增加，IL-4降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。维生素D干预组小鼠各细胞因子表达水平比感染组小鼠高，且IFN-γ表达水平差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表3 维生素D对结核感染小鼠外周血T细胞因子的影响（±s）

表3 维生素D对结核感染小鼠外周血T细胞因子的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01，**P＜0.001；与感染组比较，#P＜0.01

指标 对照组 感染组 维生素D干预组IFN-γ 28.26±11.45 61.57±20.19** 75.31± 2.17**#IL-4 19.34±8.67 14.15±12.01** 13.9±1.72**Il-17 17.16±7.24 21.49±10.34** 20.91±3.21**TGF-β 12.04±4.91 18.48±6.65* 19.13±0.26*

3 讨论

自2007年以来，结核病一直位居单一传染病死因之首，甚至高于人们熟知的艾滋病，是全球前十位死因之一［1］。韩俊锋等［6］证实肺结核患者血清中维生素D水平低于正常人群，维生素D缺乏与肺结核的严重程度相关，同时增加肺结核的传染性及患病风险，使活动性肺结核治疗的疗程延长和痰转阴时间延长。

近年来，维生素D在先天性免疫和获得性免疫系统的研究逐渐被重视［7］，维生素D与其受体结合后，会促使获得性免疫细胞释放IFN-γ，IFN-γ进一步激活先天免疫细胞巨噬细胞来吞噬结核菌，且巨噬细胞会释放一种阳离子细胞杀伤肽（LL-37），进一步抵抗结核菌的毒性作用［8］。维生素D的缺乏也被证实与肺部的多种疾病相关，包括肺结核疾病、急性肺损伤、哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化等［9］。但GANMAA等［10］提出补充维生素D并未显著预防结核病感染风险，因此维生素D的作用存在争议。

维生素D在体内多种酶的作用下转变为1，25-二羟维生素D3，而通过巨噬细胞和树突状细胞呈递的1，25-二羟维生素D3可介导T细胞对维生素D产生反应，导致炎症性Th1和Th17细胞的抑制，同时诱导免疫耐T调节（Treg）反应［7］。本研究结果表明，维生素D干预组均出现CD3+T，CD4+T细胞比例及CD4+/CD8+比值增加，CD8+T细胞降低，提示维生素D可以进一步免疫调节。

Th1细胞主要介导细胞免疫，通过巨噬细胞杀灭组织内的病毒、细菌等，Th2细胞与超敏变态反应，如过敏性皮炎、过敏性哮喘等密切相关［11］。本研究显示，维生素D干预组和感染组小鼠出现IFN-γ、IL-17及TGF-β升高，IL-4降低，同时维生素D干预组小鼠IFN-γ表达水高于感染组，提示免疫应答以Th1细胞为主。一项研究［12］指出在利用卡介苗导致小鼠结核感染的模型中，维生素D添加组与缺乏组相比，维生素D缺乏会影响结核感染小鼠的免疫能力，导致CD4+T细胞及CD8+T细胞下降，CD4+/CD8+比值上升，IFN-γ下降，IL-10上升。表明与免疫损伤密切相关的CD4+/CD8+比值与结核易感程度呈负相关，而IFN-γ与本研究结果相反，这可能需要更多的研究去证实。