三种实验室诊断技术在结核病诊断中的应用价值

潘清波 余旭良 郑小金 袁罗翔 祝进

肺结核病是一种由结核分枝杆菌引起的病死率较高的慢性疾病，全球公共卫生安全领域均面临巨大的挑战［1］。据世界卫生组织估计，全球每年因结核病而引起的死亡人数达300万人，我国是全球22个结核病高感染率的国家之一［2］，结核病的发病率达99/10万人。目前肺结核实验室检测方法主要是抗酸杆菌染色法和细菌培养法。近年来，WHO向全球推荐了新的检测耐药结核病的方法GeneXpert MTB/RIF［3］，主要应用于肺结核的快速诊断及结核菌对利福平的敏感性检测。有报道称，在不同地区的GeneXpert MTB/RIF系统对于肺结核病的诊断存在差异［4］。作者对临床上诊断为肺结核患者的痰液进行抗酸染色、液体培养、GeneXpert MTB/RIF检测，评价三种方法诊断肺结核的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年1~8月本院就诊并住院的结核患者或疑似结核患者584例，男478例，女106例；年龄14~92岁。临床表现有咳嗽、咯血、低热或CT显示肺部有阴影等，且排除其他疾病。均留取痰标本进行抗酸染色、液体培养和GeneXpert系统检测结核分枝杆菌。根据我国肺结核诊断标准（WS 288-2017），具有典型的结核病临床症状，且至少符合以下几项之一：（1）MTB病原学检测阳性；（2）病理学诊断支持；（3）影像学检查支持活动性结核；（4）＞2次TBIGRA阳性且抗结核治疗有效。584例患者中最终诊断为肺结核193例。

1.2 方法 （1）仪器试剂：GeneXpert仪器及配套试剂；KS-S100 Series染片机；抗酸染色液；奥林巴斯显微镜、海尔二级生物安全柜，MGIT320分枝杆菌培养仪器。（2）标本采集：嘱咐患者留取深部痰液（晨痰、夜间痰、随机痰），同一个标本分别进行抗酸染色、液体培养及GeneXpert MTB/RIF检测。（3）检测方法：①抗酸染色：先准备干净的玻片并做好标本序号标记，竹签挑取痰液制成痰片干燥后，酒精灯加热固定，再上机染色，严格按照KS-S100 Series染色机SOP操作，染好后取出待完全干燥后镜检。②液体培养法：严格按照SOP进行操作，将痰液标本与2% NALC-NaOH 1∶1或1∶2混匀消化处理15 min后，加入缓冲液后离心，弃去上清液，加入1 mL缓冲液充分混匀后，加0.5 mL沉淀混悬液至液体管中，放入液体培养仪器中。仪器培养报阳的标本进行涂片和MPB64胶体金确认。③GeneXpert MTB/RIF：痰液标本视黏稠程度加入消化液处理15 min，中途振荡1~2次，充分消化后的标本加入到试剂盒中，然后进行上机检测。由GeneXpert检测仪器根据内置程序判定菌种和利福平耐药性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验，以临床诊断为金标准，评价三种检测方法的诊断效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种检测方法阳性率比较 193例结核患者中，痰涂片检测阳性率25.9%，痰培养检测阳性率60.6%，GeneXpert系统检测的阳性率67.4%，GeneXpert系统检测的阳性率＞痰培养＞痰涂片。GeneXpert系统阳性率与痰培养比较，差异无统计学意义（χ2=1.900，P＞0.05），比抗酸染色阳性率明显提高，差异有统计学意义（χ2=66.624，P＜0.05），见表1。

表1 结核组三种检测方法阳性率比较（n=193）

2.2 三种方法检验效能比较 三种方法的敏感度分别为25.9%、60.6%、67.4%，特异度为95.1%、99.5%、98.5%，阳性预测值分别为72.5%、98.3%、95.6%，阴性预测值为27.8%、83.7%、85.9%。GeneXpert系统与痰培养敏感度比较，差异无统计学意义（χ2=1.900，P＞0.05），但二者均比痰涂片敏感度高，差异有统计学意 义（χ2=66.624、47.378，P＜0.05）。GeneXpert系 统与痰培养特异度比较，差异无统计学意义（χ2=1.137，P＞0.05），但二者均比痰涂片特异度高，差异有统计学意义（χ2=6.983、14.142，P＜0.05）。见表2。

表2 肺结核诊断中三种检测方法的诊断效能评价

2.3 GeneXpert和液体培养检测利福平耐药性比较 193例结核患者菌株进行液体药敏试验，检测出利福平耐药15例，敏感178例。GeneXpert 系统检测利福平耐药17例，利福平敏感176例。两种方法共同对利福平耐药14例，共同敏感175例。以液体药敏试验为金标准，可以得到GeneXpert 系统检测利福平耐药性的敏感度为93.3%，特异度为98.3%，阳性预测值82.4%，阴性预测值为99.4%，见表3。4株利福平结果两种检测方法不同的菌株经基因测序后，均为利福平敏感。

表3 GeneXpert和液体培养检测利福平耐药性比较

3 讨论

传统的抗酸染色镜检法操作简单、价格成本低，至今在肺结核的防控中仍然占有重要地位，但由于抗酸染色法的检出率低，需要大量的抗酸杆菌才能检测出，受送检痰液标本的质量影响较大，因此肺结核患者痰涂片抗酸染色阳性率偏低。痰液体培养法虽然可以提高肺结核患者痰液阳性检出率，但由于结核菌生长缓慢，所需时间较长，严重影响肺结核患者的早期治疗和防控［5］。

GeneXpert MTB/RIF系统主要是检测结核分枝杆菌rpoB基因192 bp区间判断结核分枝杆菌；大部分的利福平耐药菌株可以通过检测rpoB基因是否突变判断利福平的耐药性。五个探针包含了rpoB 基因的81 bp区域；球形芽孢杆菌作为特异性探针判断GeneXpert MTB/RIF整个实验过程的效率［6-7］。GeneXpert MTB/RIF实验步骤简单，实验室人员仅需简单培训就可以上岗。其自动进行PCR的提取、扩增、检测，2 h就可以完成实验检测［8-9］，非常有利于结核病的及时诊断。GeneXpert MTB/RIF系统对结核实验室的要求低，具备普通二级生物安全柜就可以，非常适合在基层医院使用。近年来，世界卫生组织大力推荐GeneXpert MTB/RIF系统［10］，该系统检测阳性率高、安全性高、检测时间短等优点，可较好的满足临床上对检测的要求。目前主要应用于肺内和肺外标本中结核分枝杆菌和利福平敏感性的检测等方面。

GeneXpert MTB/RIF系统检测肺结核患者的阳性率为67.4%，略低于钟莉等报道的68.87%，但高于陈小娟报道的41.94%［11-12］。痰培养阳性率为60.6%，略低于GeneXpert 系统检测的阳性率。若以痰培养为金标准，GeneXpert 系统检测的阳性率为98.3%，特异度为95.9%，与其他报道基本一致［13］。从检验效能看，GeneXpert MTB/RIF系统好于涂片法。