海南地方习用药材蛇足石杉质量标准研究

马妍 刘洋洋 冯剑 黄梦利, 邢益涛 赵明明

（1.海南医学院中医学院 海南海口 570100；2.中国医学科学院药用植物研究所海南分所/海南省南药资源保护与开发重点实验室 海南海口 570311；3.海南省中医院 海南海口 570203）

蛇足石杉为石杉科石杉属植物蛇足石杉Huperzia serrata(Thunb.ex Murray) Trev.的干燥全草，始载于《植物名实图考》[1]，云：“千层塔生山石间，蔓生绿茎，小叶攒生，四面如刺，间有长叶及梢头叶，俱如出生之柳叶。可煎洗肿毒跌打及鼻孔作痒。”，又名千层塔、蛇足石松[1-3]；多年生土生植物，叶缘具粗齿，茎高10～30 cm；生态环境极其恶劣，存于海拔200～1 400 m的林下或潮湿的沟谷岩石上。我国海南各地及广东、广西、四川、贵州、云南等地均有种植[4]。蛇足石杉味苦、辛、微甘，性平；归肺、大肠、肝、肾经；有小毒，具有散瘀止血、消肿止痛、清热解毒的功效，用于跌打损伤、劳伤吐血、尿血、痔疮下血、瘀血肿痛、肺炎[5]。海南地区蛇足石杉多用于治疗跌打损伤、虫蛇叮咬、烧烫伤等。蛇足石杉含有多种化合物并具有较高的临床药用价值，如全草含蛇足石松碱（lycoserrine）、千层塔碱（serratine）、石松碱（lycopodine）、石松文碱（lycoclavine）、石杉碱（huperzine）等生物碱，千层塔烯二醇（ serratenediol ）、千层塔烯二醇-3-乙酸酯（serratenediol-3-acetate）、千层塔烯四醇（tohogeninol）等三萜类化合物[6]。蛇足石杉水煎剂醇沉液能明显抑制小鼠的自发活动，具有抑制中枢作用[7]；石杉碱甲具有很强的可逆性抗胆碱酯酶作用，亦对记忆巩固、记忆再现效应有增强作用[8]。此外，石松碱、石松文碱对家兔和豚鼠有缩瞳作用，对福氏痢疾杆菌、宋氏痢疾杆、志贺痢疾杆菌具有敏感性，可用于治疗腹泻及痢疾等[9]。

目前蛇足石杉的研究主要集中于其药用价值、化学成分、资源分布、传统栽培技术等方面[10-16]。《中国药典》及地方药材关于蛇足石杉药材标准尚未收录。因此，为明确蛇足石杉药材质量控制标准，弥补蛇足石杉药材记载的空缺，对海南地方习用药材蛇足石杉的质量标准进行研究，为蛇足石杉药材的市场流通、临床应用及深度开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂仪器：CLPSE 80i生物显微镜（日本尼康株式会社）、UV2450紫外可见分光光度计（日本岛津制作所）、SX-G021-3马弗炉（天津中环电炉股份有限公司）。试剂：无水乙醇、FAA固定液、二甲苯、中性树胶、磷酸二氢钾、戊二醛（均为国产分析纯）。

1.1.2 试材本实验用的 10批次蛇足石杉药材样品分别采自海南省五指山市、琼中黎族苗族自治县、白沙黎族自治县、昌江黎族自治县、陵水黎族自治县等地，均为野生种，详细信息见表1。

其中，蛇足石杉对照药材（批号SZ20180302QZ07）于2018年3月采于海南省琼中黎族苗族自治县黎母山，除去杂质，晒干而得。原植物经广东药科大学郑希龙副研究员鉴定为石杉科（Huperziaceae）石杉属（Huperzia Bernh.）植物蛇足石杉Huperzia serrata(Thunb.ex Murray)Trev.，凭证（腊叶）标本保存于海南省中药标本馆（海口市药谷四路4号中国医学科学院药用植物研究所海南分所），蛇足石杉基原植物和药材见图1。

图1 蛇足石杉基原植物及药材

1.2 方法

1.2.1 性状检定参照《中国药典》[5]2020年版四部和《国家药品标准工作手册》[17]的性状检定方法，对10批蛇足石杉药材的性状特征、表面色泽、质地及气味进行检定和描述。

1.2.2 鉴别

1.2.2.1 显微鉴别参照《中国药典》[5]2020年版四部和《国家药品标准工作手册》[17]的显微鉴别法，将10批蛇足石杉药材粉碎，过四号筛；挑取少许粉末置载玻片上，滴加水合氯醛试液进行透化，加盖玻片，于生物显微镜下观察蛇足石杉药材粉末的显微结构特征。

1.2.2.2 展开剂的考察为筛选合适的展开试剂，分别选择石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（7∶7∶1∶0.035）（A）、石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（6∶6∶0.1∶0.15）（B）、三氯甲烷-甲醇-石油醚(60～90℃)-乙酸（5∶0.5∶10∶0.05）（C）、石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（10∶5∶0.5∶0.05）（D）、石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（8∶4∶0.5∶0.1）（E）作为展开剂，显色后进行对比。通过试验考察，最终选用石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（7.5∶7.5∶1∶0.035）为展开剂，结果显示，其薄层色谱的斑点集中、Rf值适中，可用于蛇足石杉的薄层鉴别研究，结果见图2。

图2 不同展开剂下薄层色谱图

1.2.2.3 薄层鉴别将蛇足石杉样品粉碎，过四号筛后取 1 g，加 95%乙醇 15 mL，超声处理30 min，滤过，浓缩至2 mL，作为供试品溶液。另取蛇足石杉对照药材粉末 1 g，同法制成对照药材溶液。参照《中国药典》[5]2020版四部通则0502薄层色谱法进行试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各15 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（7.5∶7.5∶1∶0.035）溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰后，置日光下直接检视。

1.2.3 水分、总灰分、浸出物的测定蛇足石杉药材的水分参照《中国药典》[5]2020年版四部通则0832项的烘干法进行测定；总灰分参照《中国药典》[5]2020年版四部通则2302项的总灰分测定法进行测定；浸出物参照《中国药典》[5]2020年版四部通则2201项下醇溶性浸出物热浸法进行测定。

2 结果与分析

2.1 蛇足石杉性状

蛇足石杉根为须状，黄白色。茎多断裂，不分枝或多回二歧分枝。质脆易折断，断面蜂窝状。不育叶螺旋状排列，有短柄或近无柄，披针形，长1～2.3 cm，宽2～5 mm，先端渐尖，基部楔形，边缘有不整齐的尖锯齿，主脉明显，叶纸质（图3）。能育叶与不育叶同形，孢子囊生于孢子叶的叶腋。气微，味淡。

图3 蛇足石杉叶形（叶缘具粗齿）

2.2 鉴别

2.2.1 蛇足石杉显微鉴别蛇足石杉粉末呈棕褐色（图4）；表皮细胞垂周壁波状或深波状弯曲，气孔不定式。导管少见，多为螺纹导管。孢子囊肾形，孢子囊环带偶见细胞。

图4 蛇足石杉粉末显微鉴别

蛇足石杉茎横切面（图5）：外侧可见鳞叶残基，表皮细胞1～4列，内侧具厚壁细胞数列；皮层宽广，维管束散在；内皮层窄，原生中柱为星芒状，木质部与韧皮部为外始式，呈4～8个辐射排列脊状突起，星芒脊状突起部分呈倒三角形，髓部小（图6）。

图5 蛇足石杉药材茎横切面

图6 蛇足石杉中柱放大

2.2.2 薄层鉴别将显色后的薄层板置于日光灯下直接检视，其余9批蛇足石杉供试品的薄层色谱中，在与蛇足石杉对照药材色谱相应的位置上，均显示相同颜色的斑点，如图7。

图7 十批蛇足石杉药材的薄层色谱图

2.3 水分、总灰分、浸出物的测定

十批蛇足石杉样品的水分、总灰分、浸出物测定结果见表2。10批蛇足石杉的水分平均值为9.50%，其中采自陵水吊罗山蛇足石杉水分最高（9.82%），采自昌江霸王岭东五区的水分最低（9.25%）。10批蛇足石杉的总灰分平均值为6.18%，其中采自昌江霸王岭东五区的蛇足石杉总灰分最高（9.08%），采自白沙南开乡的总灰分最低（4.54%）。10批蛇足石杉的醇溶性浸出物平均值为14.20%，其中采自昌江霸王岭东五区的蛇足石杉醇溶性浸出物最高（15.79%），采自白沙鹦哥岭的最低（12.05%）。

表2 十批蛇足石杉药材的水分、总灰分及浸出物值(n=3)

3 讨论与结论

3.1 蛇足石杉药材的水分、总灰分及浸出物检查项限值的确定

10批蛇足石杉药材的水分为9.25%～9.82%，将 10批蛇足石杉的水分平均值乘以 120%得11.39%。因此，拟规定蛇足石杉药材的水分不得超过 12.0%。10批蛇足石杉药材的总灰分为 4.54%～9.08%，将10批蛇足石杉的总灰分平均值乘以120%得7.41%。因此，拟规定蛇足石杉药材的总灰分不得超过 7.5%。10批蛇足石杉药材的醇溶性浸出物为 12.05%～15.79%，将 10批蛇足石杉药材的浸出物平均值乘以80%得11.36%。因此，拟规定蛇足石杉药材的醇溶性浸出物不得少于11.0%。

3.2 蛇足石杉指标成分的含量测定

石杉碱甲（Hup A）对胆碱酯酶具有选择性的抑制作用，并且能够通过血-脑屏障促进记忆再现和增强记忆保持，主要用于治疗重症肌无力和老年痴呆[18]，是蛇足石杉的重要活性成分[18-19]。但蛇足石杉中所含Hup A含量过低，如袁经权等[20]所测12批不同产地的蛇足石杉样品中，根、叶、茎中石杉碱甲含量最高的广西大容山蛇足石杉，仅分别为0.090 0%、0.031 7%、0.033 2%；王俊等[21]采用高效液相色谱法测得蛇足石杉中Hup A含量为0.022 6%，是23种可提取Hup A的原植物中含量较低的；杜次等[22]检测结果显示，湘西蛇足石杉中的Hup A含量更低，仅为0.518%；李关艳等[23]采用LC-MS法测定温室大棚种植的蛇足石杉茎叶所含Hup A，结果显示，茎中Hup A含量为0.044 4%，叶中为0.055 9%；顾月华等[24]测定结果显示，蛇足石杉Hup A含量为0.011 8%。本研究测定的10批蛇足石杉中，Hup A含量皆小于0.03%，且方法复杂，稳定性低，专属性不强，故蛇足石杉中石杉碱甲含量暂不录入标准研究。

本研究对海南地方习用药材蛇足石杉药材的性状、显微特征结构、薄层色谱、水分、总灰分、醇溶性浸出物等质量指标进行研究，并规定其质量标准，对确保海南地方习用药材蛇足石杉的市场流通、临床用药安全及其作为制剂原料的安全性、有效性和稳定性均具有一定的意义。