3 种饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型表型比较

孟庆楠，张晓芙，熊雪莲

复旦大学附属中山医院内分泌科，上海 200032

随着肥胖和2 型糖尿病人数的增加，非酒精 性 脂 肪 肝 病（non-alcoholic fatty live disease,NAFLD）已成为全球最常见的慢性肝病，全球患病率约为25%［1］。在我国，NAFLD 患病率已从2000 年的23.8%增长到2018 年的32.9%，成为我国发病率最高的肝脏疾病［2］。NAFLD 谱由非酒精 性 脂 肪 肝（non-alcoholic fatty liver, NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）、肝纤维化等构成。其中，NASH 为较严重阶段，以小叶炎症、肝细胞脂肪变性、肝纤维化和肝细胞死亡为病理特征［3］。NASH 在 NAFLD 人群中占比较高，且可能进展为肝硬化和肝细胞癌，且已成为肝移植和肝脏相关死亡的主要原因［4］，给全球带来巨大的卫生经济负担。

因此，深入了解NASH 的机制、研发相应药物是临床迫切需求，然而目前尚无FDA 批准的专门用于治疗NASH 的药物。研发NASH 药物的主要阻碍之一为缺少理想的动物模型。理想的动物模型应与人类疾病的生化、代谢、组织学、分子通路等多方面特征一致或接近。目前已经通过基因工程、饮食诱导、化学诱导等方法，开发了多种NASH 动物模型，然而大多数模型并不能完整复现人类NASH［5］。因此，在科学研究和药物研发时，需要深入了解各模型的特点，选择合适的动物模型或模型组合，从而提高从动物试验到临床应用的可转化性。

本研究建立了高脂饮食（high-fat diet, HFD）、Amylin 饮食，以及高脂-蛋氨酸胆碱缺乏饮食（high-fat methionine- and choline-deficient, HFMCD）诱导的NASH 小鼠模型，并检测生化、代谢等指标，评估肝脏组织学变化，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料 实验用动物均为SPF 级雄性C57BL/6 小鼠，8～9 周龄，体质量为 22～25 g，购于上海实验动物公司。小鼠饲料购于Research Diets 公司，分别为普通饲料(D11112201；65%碳水化合物，20%蛋白质，15%脂肪)，HFD 饲料（D12492；60%脂肪，20%碳水化合物，20%蛋 白 质 ），Amylin 饲 料（D09100301; 40% 脂肪，22%果糖，10%蔗糖，2%胆固醇），以及HFMCD 饲料（A06071301B; 60%脂肪，无蛋氨酸，无胆碱）。小鼠血清谷氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、血清天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST），肝 脏 三 酰甘油 (triglycerides, TG)、肝脏羟脯氨酸检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。血糖检测采用Roche 血糖仪及试纸。本研究通过复旦大学附属中山医院动物伦理审批（ZS334）。

1.2 动物饲养 小鼠饲养于复旦大学上海医学院实验动物中心，屏障环境为(22±2)℃，相对湿度保持在40%～60%，给予12 h 交替光照，小鼠自由进食、进水。根据饮食分为普通饮食（chow diet，CD）组、HFD 组、Amylin 组和HFMCD 组，每组10 只。其中，HFD、Amylin 饲料喂养时长为24 周，HFMCD 饲料喂养时长为10 周。喂养期间，通过在实验开始、换笼期间和实验结束时称量食物质量来监测食物消耗。

1.3 血清指标检测 喂养结束时，取小鼠眼眶静脉血；血液静置于无内毒素试管2 h，在4℃、1 000×g 条件下离心 10 min 后取上清液（血清）。血清ALT、AST，肝脏TG、肝脏羟脯氨酸检测均按照试剂盒说明书进行。小鼠禁食10 h 后，尾尖采血，用血糖仪测定其空腹血糖值。胰岛素耐量试验（insulin tolerance test, ITT）：小鼠禁食 4 h 后所测血糖值记为0 min 血糖，随后腹腔注射胰岛素（0.75 U/kg），分别检测注射胰岛素后15、30、45、60、90、120 min 时间点的血糖并用 0 min 血糖值矫正，绘制曲线。

1.4 肝组织石蜡切片及病理检查 取血后，用颈椎脱位法处死小鼠，剥离肝脏。肝脏称质量后，取1 cm×1 cm×0.5 cm 大小肝组织，浸于 4%多聚甲醛固定24 h，随后用浓度递增乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，最后切片。肝指数=肝脏质量/小鼠体质量。

苏木精-伊红（H-E）染色：将石蜡切片梯度脱蜡后，用苏木精染色1 min，水洗，1%盐酸乙醇分化数秒，水洗，1%氨水返蓝30 s，再次水洗，用伊红染液染色2 min，洗涤；常规用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。天狼星红染色：将石蜡切片梯度脱蜡后，用Weigert 铁苏木精染液染色10 min，水洗，天狼星红染液滴染1 h，水洗；常规脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.5 统计学处理 用 GraphPad Prism 9.0.0 软件作图与进行统计学分析，数据以x±s 表示，组间比较采用t 检验，检验水准（α）为0.05。

2 结 果

2.1 小鼠体质量和肝脏重量 HFD 组、Amylin组小鼠体质量显著高于CD 组（P＜0.000 1）；HFMCD 组体质量与CD 组差异无统计学意义。HFD 组、Amylin 组、HFMCD 小鼠肝脏质量均高于 CD 组（P＜0.01）。Amylin 组、HFMCD 组 小鼠肝指数高于CD 组（P＜0.01）；HFD 组小鼠肝指数与CD 组差异无统计学意义。Amylin 组肝脏质量、肝指数较CD 组的升高倍数明显更大（表1）。

表1 各组小鼠的体质量、肝脏质量和肝指数比较

2.2 生化指标 饮食诱导组小鼠的血清ALT 水平均高于CD 组（P＜0.05），其中HFD 组升高程度较小；Amylin 组和HFMCD 组小鼠血清AST 高于CD 组（P＜0.01），HFD 组 与 CD 组 AST 差 异 无统计学意义。饮食诱导组肝脏TG 含量均高于CD组（P＜0.01），其中Amylin 组升高程度最大。Amylin 组与HFMCD 组肝脏羟脯氨酸水平高于CD组（P＜0.01），HFD 组和CD 组肝脏羟脯氨酸水平差异无统计学意义（表2）。

表2 各组小鼠血清ALT、AST，肝脏三酰甘油、羟脯氨酸和空腹血糖比较

2.3 空腹血糖和ITT HFD 组和Amylin 组小鼠空腹血糖水平升高，HFMCD 组小鼠空腹血糖水平降低（P＜0.01，表2）。ITT 试验中，Amylin 组各时间点血糖水平高于CD 组（P＜0.001），且升高最明显；HFMCD 组各时间点血糖水平与CD 组差异无统计学意义（图1）。

图1 各组小鼠的ITT 测试结果

2.4 肝脏组织学 H-E 染色（图2A）显示：CD组肝脏组织结构完整，肝小叶清晰；饮食诱导组均出现肝脂肪变性及肝小叶炎性浸润，脂肪变性严重程度依次为Amylin 组、HFMCD 组、HFD 组。天狼星红染色（图2B）显示：饮食诱导组均有胶原纤维形成，其中HFMCD 组、Amylin 组胶原纤维形成较多，说明肝纤维化严重。

图2 各组小鼠肝脏切片的H-E 染色（A）及天狼星红染色（B）

3 讨 论

NASH 已成为全球性的健康问题，而动物模型无法很好模拟人类疾病阻碍了相关药物的研发。因此，需要正确选择或组合动物模型，从而更准确地预测药物在人体内的反应［6］。将不同模型相结合以利用各自的优势是NASH 研究的常用方法，例如db/db、ob/ob 基因突变小鼠常用于研究与早期NAFLD 相关的代谢综合征，蛋氨酸胆碱缺乏（methionine- and choline-deficient, MCD）模型常用于研究短时间内NASH 肝脏的晚期纤维化［7］。本研究建立了3 种饮食诱导的NASH 小鼠模型，比较NASH 相关指标，旨在评估各模型的临床可转化性。

HFD 被广泛用于诱导实验动物发生NASH。HFD 模型与人类 NASH 多种表型相似，包括肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常等［8］。然而，该模型表型受动物品系、饮食中脂肪的含量、各类脂肪的组成以及诱导持续时间等影响［9］。而且，HFD诱导的肝损伤常不严重［10］。本研究显示，与CD组相比，HFD 组体质量升高，并出现明显的胰岛素抵抗，但是肝细胞受损指标ALT、肝纤维化指标羟脯氨酸升高不明显，肝组织染色也显示小鼠NASH的特征性病理表现不如其他饮食诱导模型严重。

Amylin 饮食能可靠诱导类似人类疾病生化、代谢和组织学等特征的动物模型［11］。本研究中，Amylin 组小鼠体质量、肝脏质量、胰岛素敏感性下降及肝脏病变程度均高于CD 组，NASH 表型与人类类似。因此，Amylin 饮食诱导的NASH 具有较高的临床可转化性。然而，近期FDA 禁止将反式脂肪作为食品添加剂。目前已研发出可替代Amylin 饮食的 Gubra Amylin NASH（GAN）饮食，GAN 与Amylin 饮食具有相同的能量比例和类似的诱导效果［12］。

HFMCD 是近期新建立的NASH 诱导饮食，为HFD 和 MCD 两种饮食结构的结合［13］。MCD已被广泛用于NASH 研究，能快速诱导多个严重的NASH 表型，但不能诱导胰岛素抵抗［14］。既往研究［15］评估了HFMCD 的诱导效果，发现其能迅速诱导肝损伤、脂肪累积、炎症反应和纤维化，不导致显著的体质量改变，但使肝指数增加。然而，HFMCD 同样不能导致胰岛素抵抗［16］。本研究得出相似结果。

目前，国内外鲜见研究对上述3 种饮食模型进行比较。本研究结果说明，3 种饮食诱导的NASH小鼠模型各有优劣势：HFD 能有效诱导肥胖、胰岛素抵抗等NASH 患者常见的代谢紊乱，但难以导致严重的肝脏病变；Amylin 饮食不仅能引起显著的肥胖和胰岛素抵抗，其诱导的肝脏病变也较严重；HFMCD 相较于前2 种模型，能更迅速引起明显的NASH 特征，但不能导致肥胖和胰岛素抵抗。

综上所述，本研究为NASH 机制研究和药物研发中临床前模型的选择提供了一定参考。未来可通过分析各动物模型中人类NASH 中的关键信号通路（如炎症信号、凋亡信号）的变化，并从转录组、代谢组学角度评价动物模型，以进一步改进动物模型，进而更好地服务于临床。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。