旱辣蓼质量标准研究

周朝忠，康兴东，毛金娣，旷春兰

（江西普正制药股份有限公司，江西 343100）

旱辣蓼为蓼科植物旱辣蓼（Polygonum flaccidum Meisn.）的干燥全草，又名辣蓼草、辣子草、红辣蓼、蓼子草等，具有除湿，化滞，散瘀止血，祛风止痒，解毒的功效，用于湿滞内阻，脘闷腹痛，泄泻，痢疾，小儿疳积，崩漏，经闭痛经，风湿痹痛，便血，湿疹，皮肤瘙痒，足癣，痈肿等疾病的治疗，主产于江西、广西、贵州、福建等地［1］。旱辣蓼的成分包括挥发油、鞣质、酚酸、黄酮、蒽醌等。没食子酸等鞣质类成分具有收敛、止泻、止血、抗菌、抗病毒等作用［3］；黄酮类成分具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用；鞣质类成分和黄酮类成分均是辣蓼的主要药效作用成分［3-5］。

辣蓼用药历史悠久，其标准收载于1977年版《中国药典》、2010版《中国兽药典》和北京、上海、贵州等多个省的地方标准中，其中1977年版《中国药典》中辣蓼项下包括水辣蓼和旱辣蓼两种来源，但标准较为粗疏，仅做性状鉴别［2］。近年来对水辣蓼的研究相对较多，而旱辣蓼研究较少。本试验采集10批旱辣蓼，考查其显微特征、TLC薄层色谱特征、水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、重金属及有害元素等方面；此外，因没食子酸等鞣质类成分是辣蓼治疗痢疾的主要作用成分，没食子酸是没食子酸鞣质的单体成分［4］，故本研究选择采用HPLC法测定没食子酸含量，为该药材质量标准建立和规范使用提供科学依据。

1 材料、仪器与试药

1.1 材料 试验所用旱辣蓼药材共10批（其中产地采集6批，药材市场购买4批），经江西普正制药股份有限公司吴永忠研究员鉴定为旱辣蓼Polygonum flaccidum Meisn.的干燥全草。具体信息见表1。

表1 旱辣蓼样品信息

1.2 仪器设备 美国Waters1525-2489型高效液相色谱仪；AUW2200十万分之一电子分析天平（SHIMADZU岛津）；AB104-N万分之一天平（梅特勒-托利多）；JK-300型超声波清洗仪（合肥金尼克机械制造有限公司）；SK160 Digital生物显微镜（麦克迪奥光学仪器有限公司）；SX2-4-10马弗炉（上海实验仪器厂）；TAS-990AFT原子吸收分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.3 试剂与试药 没食子酸（批号110831-200803）、芦丁（批号100080－200707）购自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，西陇科学股份有限公司）、甲醇（分析纯，天津市恒兴化学试剂有限公司）、磷酸（分析纯，天津市恒兴化学试剂有限公司）、盐酸（分析纯，天津市恒兴化学试剂有限公司），水为自制超纯水；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）、聚酰胺薄膜板（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 取旱辣蓼茎横切面切片，置显微镜下观察；旱辣蓼药材粉碎，过四号筛，挑取少许置载玻片上，分别制备装片和透化片，置显微镜下观察。

2.1.1 茎横切面特征 表皮细胞1列，外被角质膜，下皮层有2~3列厚角细胞，皮层为1列薄壁细胞，含有草酸钙簇晶。中柱鞘纤维束断续排列成环状，壁木质化。初生韧皮部较窄，部分形成层不明显，木质部导管单个或数个相聚，呈放射状或环状排列。髓射线宽7~16列细胞，线状排列。髓部薄壁细胞大，壁薄，髓中细胞萎缩呈不规则空洞。本品皮层、髓部薄壁细胞内含草酸钙簇晶和淀粉粒，木质部导管为螺纹导管。见图1。

图1 旱辣蓼茎横切面显微图

2.1.2 粉末特征 淀粉粒单粒长圆形，直径20～30 μm；可见草酸钙簇晶，直径20～40 μm；草酸钙方晶，长20～40 μm；可见非腺毛，稍弯曲，长100～300 μm；可见螺纹导管，长60～80 μm。见图2。

2.2 薄层色谱鉴别 黄酮类成分是辣蓼的主要活性成分，本研究以芦丁作为黄酮类成分的代表性成分对辣蓼进行定性质量控制［5］。

2.2.1 对照品溶液的制备 取芦丁对照品，加乙醇制成2 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取旱辣蓼粉末1 g加乙醇15 ml，40 KHz超声30 min，滤过，回收乙醇，浓缩成稠浸膏状，加乙醇0.5 ml溶解后作为供试品溶液。

2.2.3 检测方法 照薄层色谱法（2015年版《中国药典》四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5 μl分别点于聚酰胺薄膜上，以醋酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，待乙醇挥干后，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图3。由图可知，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的黄绿色荧光斑点。

2.3 水分、灰分和浸出物检查 按2015年版《中国药典》方法测定［6-7］，结果见表2，10批旱辣蓼中水分含量为6.5%～10.5%，平均值为8.8%；总灰分含量为8.5%～13.7%，平均值为11.7%；酸不溶性灰分含量为0.8%～3.7%，平均值为2.5%；水溶性浸出物含量为18.7%～23.7%，平均值为21.0%；醇溶性浸出物含量为5.5%～13.0%，平均值为7.6%。

表2 水分、灰分和浸出物含量测定结果

2.4 重金属及有害元素 按2015年版《中国药典》方法（通则2321原子吸收分光光度法）测定［7］，结果见表3。10批旱辣蓼中铅含量为0.3～4.7 mg/kg，平均值为1.8 mg/kg；镉含量为0.10～0.41 mg/kg，平均值为0.22 mg/kg；砷含量为0.2～1.2 mg/kg，平均值为0.5 mg/kg；汞含量为0.00～0.02 mg/kg，平均值为0.00 mg/kg；铜含量为17.8～54.5 mg/kg，平均值为36.0 mg/kg。

表3 铅、镉、砷、汞和铜测定结果 mg/kg

2.5 含量测定

2.5.1 色谱条件Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30℃；流动相：甲醇-0.1%磷酸（12∶88）；检测波长：268 nm；流速1.0 ml/min，进样10 μl［4，8］。理论板数按没食子酸峰计算应不得低于2 000。色谱图见图4。

图4 对照品（A）供试品（B）HPLC色谱图

2.5.2 溶液制备

2.5.2.1 对照品溶液的制备 精密称定没食子酸对照品适量，加50%甲醇制备成0.384 5 mg/ml的对照品储备溶液，再取储备溶液5 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，即得38.45 μg/ml对照品溶液。

2.5.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过4号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10%盐酸50 ml，称定重量，加热回流3 h，放冷，再称定重量，用10%盐酸补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2 ml转移至10 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5.3 线性关系考查 精密量取0.384 5 mg/ml的没食子酸对照品储备溶液，稀释成3.845、7.690、15.38、23.07、30.76、38.45和76.90 μg/ml的系列溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定。以进样量为横坐标（μg），峰面积为纵坐标并进行回归分析，得回归方程Y=29 631X-52 266，（r=0.999 6）。结果显示没食子酸在3.845～76.9 μg/ml范围内线性关系良好。

2.5.4 精密度试验 精密吸取没食子酸（38.45 μg/ml）对照品溶液10 μl，在“2.5.1”项色谱条件下重复测定6次，测得没食子酸峰面积RSD为1.28%，表明仪器精密度良好。

2.5.5 稳定性试验 将HLL7的供试品溶液分别于0、1、2、3、5、8和12 h，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，测得样品中没食子酸峰面积RSD为1.5%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.5.6 重复性试验 取HLL7样品，按“2.5.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.5.1”项下色谱条件分别测定，测得样品中没食子酸峰面积RSD为1.6%，表明该方法重复性良好。

2.5.7 回收率试验 取HLL7的粉末6份，每份约0.7 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入含没食子酸对照品（浓度18.164 μg/ml）的10%盐酸溶液50 ml，称定重量，加热回流3 h，放冷，再称定重量，用10%盐酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照“2.5.1”项下的方法进样测定，计算得平均回收率为97.2%，RSD为2.62%，结果表明本方法具有良好的回收率。见表4。

表4 没食子酸回收率试验结果（n=6）

2.5.8 样品测定 取本品10批，每批约1 g，按“2.5.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，计算含量，结果见表5。

表5 旱辣蓼药材中没食子酸含量测定结果

3 讨论

3.1 薄层鉴别 试验发现，超声提取和回流提取对供试品制备基本无差别，但超声提取较方便，故选择超声提取。耐用性试验结果显示，不同薄层板（预制硅胶G板、聚酰胺薄膜板）对鉴别效果有明显区别，聚酰胺薄膜分离效果较好，硅胶G板显色效果不好；不同温度（5、26℃）和不同湿度（32%、60%、90%）考查，发现温、湿度变化对展开效果影响不大。

3.2 水分、灰分和浸出物测定 参照2015年版《中国药典》［3］方法，进行了水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物和醇溶性浸出物样品测定，其中醇溶性浸出物采用热浸法，考查了不同醇浓度（50%、70%和95%乙醇）为浸出溶剂时的浸出物的量，结果显示50%乙醇为浸出溶剂浸出效果最好，建议优化浸出溶剂为50%乙醇，醇浸出物（热浸法）不得少于5.0%。此外，水溶性浸出物含量较高，建议水溶性浸出物不得低于18.0%。

3.3 重金属及有害元素 参照2015年版《中国药典》对白芍等中药材要求，铅不得过百万分之五；镉不得过千万分之三；砷不得过百万分之二；汞不得过千万分之二；铜不得过百万分之二十。经检测，10批样品中的铅、砷、汞含量均符合要求；3批样品中的镉含量超标；8批样品中的铜含量超标；旱辣蓼药材的镉和铜含量超标情况需要高度关注。由于旱辣蓼来源极广，且多为野生，检测结果提示旱辣蓼可能对镉、铜等重金属元素有一定的富集作用。

3.4 含量测定 紫外扫描显示没食子酸在268 nm波长处有最大吸收，故确定检测波长为268 nm。再进行方法学优化，对不同提取溶剂及提取方式（50 ml 50%甲醇超声30 min、50 ml 10%盐酸超声30 min、50 ml 10%盐酸回流30 min）进行考查，发现10%盐酸回流提取率较高，故采用10%盐酸回流提取制备供试品；再对提取时间（50 ml 10%盐酸回流0.5、1、1.5、2、2.5、3和3.5 h）、提取溶剂用量（50%盐酸25、50、75和100 ml）、不同品牌色谱柱（Sun Flre C18柱、Diamonsil C18柱、依利特C18柱）等进行了考查，优化确定提取时间为3 h，提取溶剂用量为50 ml，并发现不同色谱柱对检测结果无影响。