地龙蛋白改善糖尿病勃起功能障碍大鼠的作用机制*

张爱平 武兵兵 刘黎明 冀小卫 王新平 王 鑫 剡 锐 马玉虎 邢喜平**

1.甘肃中医药大学(甘肃 兰州 730000);2.甘肃中医药大学附属医院(甘肃 兰州 730020);3.兰州大学第一医院(甘肃 兰州 730000);4.临夏州妇幼保健院(甘肃 临夏 731100)

我国糖尿病患者在逐年上升[1],持续的高糖环境会激活氧化应激与炎症反应,进一步损伤大鼠睾丸、阴茎结构,导致睾酮降低,影响勃起功能[2]。 目前临床主要以5 型磷酸二酯酶抑制剂(PDE5)对症治疗,但因其价格昂贵、不良反应较多、患者医从性差且部分患者存在耐药性,导致其使用有限。 中药治疗阴茎勃起功能障碍疗效显著,本文用地龙蛋白干预糖尿病勃起功能障碍(diabetes mellitus erectile dysfunction,DMED)大鼠。从中医基础理论到临床实践,为临床治疗DMED 提供理论依据、为实验拓展新思路。

材料与方法

一、实验动物、主要试剂和仪器

甘肃中医药大学动物实验中心提供(许可证编号:SYXK(甘)2020-0001)SPF 级雄性60 只SD 大鼠,体质量200±20g,实验经甘肃中医药大学动物实验中心伦理委员会批准(编号:2020-149),符合实验动物伦理委员会相关指导原则。 枸橼酸西地拉非片(齐鲁制药有限公司,批号:1D0291D82);地龙蛋白(宝鸡市方晟生物开发有限公司, 批号: 20210511); 链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(北京索莱宝科技有限公司,批号:421D022);APO (阿 朴 吗 啡, 美 国, APExBO, 批 号:B6936113377BD);核因子E2 相关因子2(nuclear factory erythroid-2 related,Nrf2)抗体(genetex,43950);核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、甘油酸-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体(immunoway,批号分别为B1101,B1501);超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)试剂盒(南京建成,20211015);丙二醛(Malon dialdehyde,MDA)试剂盒(南京建 成,20211015); 睾 酮(testosterone, T) 试 剂 盒(Sinobestbio,202112)。 血糖仪(爱科来医疗科技(平湖)有限公司);病理切片机(上海莱卡仪器有限公司);显微拍照系统(奥林巴斯有限公司);酶标仪(美国Bio Rad 公司)。

二、建立DMED 大鼠模型、实验分组及给药

大鼠饲养于甘肃中医药大学动物实验中心SPF级实验室,自由进食饮水,室温22℃～25℃,相对湿度45% ～55%,12h/12h 光照黑暗循环。 适应性喂养1周后,记录血糖和体重作为基线,根据随机数字表法选取50 只,通过腹腔注射STZ(50mg/kg)构建糖尿病大鼠模型,剩余10 只注射等量的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液做空白组。 记录随机血糖。 若血糖＞16. 7mmol/L,则初步判定为糖尿病大鼠, 若期间随机血糖＜16.7mmol/L,则被剔除实验。[3]8 周后,参照Heaton[4]方法,选择一安静、光线昏暗房间,在大鼠颈部注射APO(100ug/kg),记录30min 内阴茎有无勃起、阴茎勃起次数。 有勃起者剔除实验,未见勃起者为DMED 大鼠,大鼠阴茎勃起的标准为:龟头露出充血,包皮后退,阴茎膨大增长。 将建模成功的大鼠随机分为5 组,空白组和模型组(生理盐水10mL/kg)、西地那非组(5mg/kg)、地龙蛋白低剂量组(0.045g/kg)、地龙蛋白中剂量组(0.090g/kg)、地龙蛋白高剂量组(0.180g/kg),干预4 周。

三、阴茎海绵体内压(ICP) 及平均颈动脉压(MAP)的测定

大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(40mg/kg)使其麻醉,麻醉后剃除颈部、下腹部毛发,沿气管两侧暴露颈总动脉,沿正中线暴露大鼠腹部,寻找前列腺,暴露海绵体神经。 将大鼠阴茎组织拖出,切开阴茎包皮,使用电极钩住海绵体神经以刺激阴茎勃起,将PE-50 管内部充满肝素生理盐水对大鼠右侧颈总动脉和海绵体进行插管。 记录平均颈动脉压(MAP)和勃起状态下阴茎海绵体内压力(ICP)的值。 使用生理盐水清洗睾丸和海绵体组织,记录其质量。 将海绵体组织分为三段,将一侧睾丸和一段海绵体组织用4%多聚甲醛固定,其余放至-80℃冰箱保存。

四、大鼠一般情况、随机血糖及体质量检测

每周记录大鼠随机血糖、体重,观察大鼠饮食,皮毛光泽度,大小便和精神状态。

五、HE 染色观察大鼠睾丸、阴茎组织病理形态学改变

各组大鼠睾丸、阴茎组织用4%多聚甲醛溶液固定,脱水,石蜡包埋,切片,二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水,苏木素染色,伊红染色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,HE 染色后封片,于200 倍显微镜下观察睾丸、阴茎组织结构改变。

六、检测血清SOD、MDA、T 含量

血清SOD、MDA、T 含量,严格按照试剂盒操作步骤进行。

七、免疫组织化学染色方法检测睾丸组织Nrf2、NF-κB的表达情况

将睾丸组织取材、固定、脱水、包埋切片,二甲苯及梯度酒精脱蜡,3%H2O2消除过氧化物酶,0.01M 柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)90℃进行抗原修复,5%BSA 封闭抗原,4℃孵育一抗(Nrf2 抗体1:400,NF-κB 抗体1 ∶250稀释)过夜,滴加二抗37℃孵育1h,加入DAB 显色,镜下控制显色时间,放入蒸馏水终止反应。 苏木精染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。 使用显微拍照系统观察各组片子。 使用ImageJ 计算各张片子灰度值。

八、数据分析采用SPSS25.0 软件分析

实验结果用均数±标准差(±s)表示,首先进行正态性及方差齐性检验,符合正态分布及方差齐性的计量资料采用两组间比较,采用两独立样本t检验,多组间数据比较采用单因素方差分析法(one-way ANOVA),非正态数据间两两比较采用秩和检验,P＜0.05 为有统计学意义。

实验结果

一、大鼠勃起功能评价

与空白组相比, 模型组大鼠ICP 明显下降(P＜0.01),与模型组相比,各治疗组大鼠ICP 显著提高(P＜0.01);与空白组相比,模型组大鼠ICP/MAP 下降(P＜0.01),与模型组相比,各治疗组大鼠ICP/MAP 显著提高(P＜0.01),各组间MAP 无显著差异,见表1。

表1 药物对大鼠勃起功能的影响

二、大鼠一般情况

空白组饮食正常,毛发色泽光亮、精神状态良好,大小便一般。 模型组与西地拉非组大鼠毛色发黄,明显消瘦,行动迟缓,精神萎靡,多饮多食,尿量增加;地龙蛋白组上述症状稍有改善。

三、地龙蛋白对大鼠血糖和体重的影响

与空白组相比, 造模后各组血糖显著升高(P＜0.001),且稳定,造模情况良好。 治疗后,与空白组相比,各组血糖明显升高(P＜0.001),与模型组相比,各给药组血糖无明显差异(P＞0.05),见表2。

表2 药物对大鼠血糖的影响(±s,n=6)

表2 药物对大鼠血糖的影响(±s,n=6)

注:表示与空白组相比*P＜0.001。

组别 造模前 造模3 天 造模1 周 造模4 周 造模8 周 给药2 周 给药4周空白组 4.97±0.39 4.95±1.09 5.02±0.53 4.23±0.78 4.2 2±0.33 5.05±0.91 4.78±0.89模型组 4.07±0.58 26.32±5.20* 20.83±2.94* 24.37±3.76* 25.07±3.94* 24.65±3.75* 27.65±8.29*西地拉非组 4.12±0.19 24.75±6.68* 20.38±4.21* 24.62±6.67* 27.45±4.09* 25.42±4.87* 31.18±2.71*地龙蛋白低剂量组4.58±0.23 22.62±7.60* 21.23±2.73* 29.62±4.29* 27.02±4.34* 25.17±5.00* 24.35±6.31*地龙蛋白中剂量组4.28±0.39 23.81±5.78* 21.94±3.73* 22.01±2.21* 28.15±3.98* 23.43±4.13* 26.36±4.46*地龙蛋白高剂量组4.45±0.35 25.17±5.60* 23.13±3.98* 22.43±2.41* 27.45±3.96* 22.57±5.77* 24.37±7.02*

空白组大鼠体重随时间延长增加明显,各给药组大鼠体重前4 周增加缓慢,4 周后体重开始下降;与空白组相比,治疗后各组体重显著下降(P＜0.001),与模型组相比各治疗组体重无明显差异(P＞0.05),见表3。

表3 药物对大鼠体重的影响(±s,n=6)

表3 药物对大鼠体重的影响(±s,n=6)

注:表示与空白组相比*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。

组别 造模前 造模3 天 造模1 周 造模4 周 造模8 周 给药2 周 给药4周空白组 299.05±14.8 336.33±17.68 356.67±20.57 416.33±31.90 471.33±37.45 499.00±38.89 513.33±38.94模型组 297.50±15.03 293.83±15.08 299.00±30.72 321.17±35.82** 315.33±33.73*** 328.00±37.55*** 289.33±48.96***西地拉非组 305.50±11.41 298.00±15.02 315.00±19.35 328.50±27.38** 317.17±55.14** 303.50±42.31*** 276.00±46.03***地龙蛋白低剂量组 297.50±23.70 289.33±30.54 301.33±36.58 306.67±43.39** 324.50±27.90*** 304.17±37.37*** 256.17±45.11***地龙蛋白中剂量组 301.17±20.35 295.00±24.42 316.83±30.86 312.00±49.87* 303.83±48.35*** 322.00±43.82*** 287.83±62.51***地龙蛋白高剂量组 305.50±18.56 298.83±17.43 324.67±19.30 336.33±33.02* 335.67±28.16*** 254.17±26.80*** 312.33±29.34***

四、地龙蛋白对大鼠睾丸指数的影响

与空白组相比,模型组大鼠睾丸指数显著降低(P＜0.01),与模型组相比,西地拉非组、地龙蛋白中剂量组、地龙蛋白高剂量组睾丸指数明显增加(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01),地龙蛋白低剂量组无统计学意义见表4。 睾丸指数(睾丸指数指大鼠睾丸质量除以大鼠体重)

表4 药物对大鼠睾丸指数的影响(±s,n=6)

表4 药物对大鼠睾丸指数的影响(±s,n=6)

注:表示与空白组相比**P＜0.01;与模型组相比#P＜0.05,##P＜0.01。

组别 剂/g·kg-1 睾丸指数(%)空白组-0.448±0.069模型组 - 0.215±0.036**西地拉非组 0.005 0.412±0.102##地龙蛋白低剂量组 0.045 0.257±0.043地龙蛋白中剂量组 0.090 0.330±0.039#地龙蛋白高剂量组 0.180 0.417±0.061##

五、地龙蛋白对糖尿病大鼠睾丸组织的影响

空白组生精小管组织结构完整,形态如常,各级精细胞排列整齐,小管内可见成熟精子;模型组生精小管变形、萎缩、固化,生精上皮细胞不同程度的脱落;各药物干预组相比于模型组均有不同程度的改善,其中西地拉非组和地龙蛋白高剂量组(地龙高)小管形态基本恢复,有成熟精子产生;地龙蛋白低剂量组(地龙低)萎缩程度较模型组有所改善见图1。

图1 大鼠睾丸组织HE 染色图片(200×)

六、地龙蛋白对糖尿病大鼠阴茎组织的影响

空白组肌纤维、胶原纤维排列整齐,血窦结构完整,内含少量红细胞;模型组肌纤维断裂,胶原纤维拧集成条状,血窦明显减少;西地拉非组血窦明显恢复,胶原纤维形态接近正常组;地龙蛋白高剂量组(地龙高)平滑肌肌纤维仍存在断裂,但胶原纤维和血窦明显恢复,地龙蛋白中剂量组(地龙中)和地龙蛋白低剂量组(地龙低)血窦较少,其中地龙蛋白低剂量组胶原纤维仍拧集,肌纤维断裂较其他治疗组明显见图2。

图2 大鼠阴茎组织HE 染色图片(200×)

七、地龙蛋白对血清SOD、MDA、T 含量

与空白组相比,模型组大鼠SOD、T 含量明显减少(P＜0.01),MDA 含量明显增加(P＜0.01),与模型组相比,各治疗组SOD、T 含量明显增加(P＜0. 001,P＜0.01),MDA 含量明显减少(P＜0.01)见表5。

表5 药物大鼠SOD、MDA、T 的影响(±s,n=6)

表5 药物大鼠SOD、MDA、T 的影响(±s,n=6)

注:表示与空白组相比**P＜0.01;与模型组相比##P＜0.01,###P＜0.001。

组别 剂量/g·kg-1 SOD(U/ml) MDA(nmol/ml) T(nmol/L)空白组- 83.72±2.60 2.85±1.02 100.14±6.65模型组 - 38.52±1.43** 6.01±0.45** 41.51±2.88**西地拉非组 5×10-3 79.14±1.31### 2.94±0.61## 94.87±5.94##地龙蛋白低剂量组 0.045 63.73±2.25### 4.65±0.76## 64.29±5.15##地龙蛋白中剂量组 0.090 70.66±3.11### 3.51±0.74## 84.44±7.69##地龙蛋白高剂量组 0.180 78.10±1.62### 3.20±0.82## 92.83±2.24##

八、地龙蛋白对各组大鼠睾丸组织Nrf2、NF-κB 蛋白表达水平的影响

与空白组相比模型组大鼠睾丸组织Nrf2 明显下降(P＜0.01),NF-κB 明显增加(P＜0.01),与治疗组相比,各给药组Nrf2 明显增加(P＜0.01),NF-κB 明显减少(P＜0.01)见图3、图4。

图3 Nrf2 免疫组化图

图4 NF-κB 免疫组化图

讨 论

阴茎勃起功能障碍(erectile dysfunetion,ED)指阴茎勃起状态下海绵体硬度和坚硬时间明显低于正常水平,持续不能达到并保持足以使性行为满意的勃起状态[5]。 糖尿病勃起功能障碍的发病机制与糖尿病患者循环高糖毒性导致的阴茎血管内皮和平滑肌病变、感觉神经功能障碍、性激素水平紊乱和心理精神因素等有关,其中T 水平低下是重要的致病机制[6]。 高糖环境会激活氧化应激,导致活性氧(ROS)的产生超出了抗氧化能力,从而引发广泛的氧化应激损伤,损伤睾丸组织,导致睾丸间质细胞(Leydig)细胞凋亡增加[7-9],影响人体T 的合成和分泌。 早期认为T 与勃起无关,仅仅对性欲有维持作用[10]。 最近研究发现,T 作用于雄激素受体,有利于平滑肌细胞保持正常的形态与功能[11]。 刘波[12]等人发现10-5mol/L T 对体外培养的大鼠海绵体SMCs 和成纤维细胞的增殖具有促进作用,有利于海绵体生长,能够改善男性性功能作用。 此外,睾酮水平与阴茎一氧化氮合酶基因的表达密切相关[13]。血清T 下降,会抑制阴茎一氧化氮合成酶合成,导致阴茎一氧化氮合成的减少,抑制NO-cGMP 信号通路,降低cGMP 含量,最终导致ED 发生[14],糖尿病患者睾酮合成与分泌减少,可能与睾丸组织损伤、性腺分泌轴功能损伤相关[15]。 本研究也证实DMED 大鼠血清中的睾酮含量明显下降。

Nrf2 是最重要的内源性抗氧化反应分子[16-17],Nrf2及其内源性抑制剂Kelch 样ECH 关联蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1,Keap1)作为一种普遍存在的、进化上保守的细胞内防御机制来抵消氧化应激。 正常情况下Nrf2 与Keap1 结合,并有靶向蛋白酶体降解,在机体受到氧化应激的情况下,Nrf2 从Keap1 分离并易位至细胞核,在此与一种小Maf 蛋白异二聚化。 异二聚体识别抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)[18],可上调醌氧化还原酶(Quinone oxidoreductase,NQO1)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、SOD、谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase,GST)的表达,对抗氧化酶基因的表达具有重要作用[19],此外还可抑制促炎因子的表达[20-21],NF-κB 是炎症损伤中起关键作用,可介导白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-8(Interleukin-8,IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等细胞因子和趋化因子产生,在控制炎症损伤中起关键作用[22]。 大量研究表明,活化的Nrf2 分子对NF-κB 具有抑制作用,Nrf2 在抵消NF-κB驱动的炎症反应中起着关键作用[23-25]。

本研究结果显示,空白组大鼠血糖稳定,体重逐渐增加,其余各组注射STZ 后大鼠血糖显著升高,糖尿病大鼠模型构建稳定。 持续的高糖环境会导致DMED 大鼠Nrf2、SOD、T 含量明显下调,同时NF-κB、MDA 等炎症因子和氧化终产物增加。 经地龙蛋白干预后睾丸组织Nrf2 表达上调,同时DMED 大鼠血清SOD、T 含量增加;而炎症因子NF-κB 和氧化最终产物MDA 释放减少。 证明地龙蛋白具有改善睾丸组织氧化应激、炎症反应作用,从而增加血清T 含量,有利于改善大鼠勃起功能。

综上所述,本研究利用糖尿病大鼠勃起功能障碍模型,探讨地龙蛋白对糖尿病勃起功能障碍的改善机制,其可能与地龙蛋白激活睾丸组织Nrf2 通路,抑制NF-κB 蛋白,发挥抗氧化应激、抑制炎症反应来保护睾丸组织,增加血清T 含量相关,为临床治疗糖尿病性勃起功能障碍提供理论依据。 糖尿病勃起功能障碍是多因素介导,其发病机制复杂,关于地龙蛋白通过其他相关途径发挥作用以及具体作用机制,未来值得探究。