快速震荡法分离培养东方田鼠腹腔巨噬细胞

何 静，杨珊珊，黄明月，张 倩，洪 炀，林矫矫，柏 熊，谢建芸，傅志强

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业农村部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241；2.上海实验动物研究中心，上海 201203）

东方田鼠（Microtus fortis）属仓鼠科，田鼠亚科，田鼠属[1]，在我国主要分布在东北、西北、黄河流域、长江流域和浙江、福建等地，是分布地的重要鼠种。东方田鼠是我国迄今为止发现的唯一一种具有天然抗日本血吸虫病特征的哺乳动物。上世纪五六十年代，我国在血吸虫病流行地区调查的39种哺乳动物中，唯有东方田鼠体内未找到日本血吸虫成虫或虫卵，流行病学调查和人工感染试验均证明其对日本血吸虫具有天然抗性，且这种抗性能稳定遗传[2-3]。东方田鼠抗血吸虫病机制研究可为血吸虫病的防治技术研究提供线索。

巨噬细胞来源于骨髓，在机体各部分分布广泛，是机体免疫系统的重要细胞成分，在抗感染、抗肿瘤和免疫调节中起着非常的重要作用。在固有免疫和适应性免疫反应中巨噬细胞起着关键性的作用，是炎性反应的主要调节细胞。当宿主发生病原体感染后，巨噬细胞在有效清除病原体方面起了关键的作用[4]。Chung等[5]研究表明，在体外培养体系中小鼠腹腔巨噬细胞依赖于抗体对曼氏血吸虫具有较大的杀伤作用。本文报告了一种东方田鼠腹腔巨噬细胞体外分离培养与鉴定的方法，为研究东方田鼠巨噬细胞对日本血吸虫杀伤作用提供一种简便可行的实验方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄雄性东方田鼠来自由上海实验动物研究中心维持的封闭群，8周龄雄性KM鼠购自购于上海斯莱克实验动物有限责任公司；DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自Hycolon公司；、HE染液、印度墨汁、酸性磷酸酶染液、α-醋酸奈酚酯酶染液等购自少辛生物有限公司。

1.2 巨噬细胞的分离与培养 8周龄东方田鼠麻醉后眼眶采血处死，用75%酒精浸泡消毒5 min，先去除东方田鼠胸腹部表皮以完全暴露腹部肌层，再用眼科镊提起腹膜，用5 mL注射器向腹腔内注射5 mL预冷的无血清DMEM培养液和1 mL空气，注意进针勿过深，不要损伤内脏及血管。快速水平振荡3 min，静置5 min，观察肠管变扁且腹腔液为淡黄色时，然后用镊子提起腹膜用注射器刺入腹腔，吸取腹腔灌洗液。无菌条件下在腹膜上剪一小口，用1 mL PBS重复灌洗2次。将回收的腹腔灌洗液置于离心管于1000 ×g、4℃离心5 min。用常规DMEM培养液（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL）调整细胞至所需浓度，接种于培养瓶或置有无菌盖玻片的6孔板内，置于37、5%CO2培养箱中，培养12 h后换液，去除未贴壁细胞。用KM鼠同样进行腹腔巨噬细胞的分离培养，作为参考和比较。

1.3 细胞形态观察 细胞培养后每日用显微镜观察细胞形态变化及生长状况。并择时将培养细胞经PBS冲洗后，用甲醛固定，常规HE染色，中性树胶封片。用显微镜观察并记录图像。

1.4 细胞吞噬功能检测 细胞培养3 d后用印度墨汁进行吞噬功能检测。在培养孔中加入10%印度墨汁50 μL，放回培养箱中孵育3 h后取出盖玻片，PBS冲洗，甲醛固定，甘油明胶封片。显微观察胞浆中吞有墨粒3个以上的为阳性细胞，镜下计数200个细胞并计算吞噬细胞阳性率。

1.5 酸性磷酸酶染色 将培养5 d的细胞经PBS冲洗后，甲醛固定，用Gomori酸性磷酸酶（Acid phosphatase, ACP）硫化铅法染色，甘油明胶封片[6]。显微观察酶活性部位为棕黄色或棕黑色颗粒，定位于细胞胞浆中。光镜下每张载片计数200个细胞并计算阳性率。

1.6 α-醋酸奈酚酯酶染色（α-ANE） 培养3 d的细胞经PBS冲洗后，冷甲醛-丙酮缓冲液固定，α-醋酸奈酚酯酶染色法染色，甲绿复染，甘油明胶封片[6]。酶活性部位为弥漫性红棕色产物，定位于细胞胞浆中，胞核为绿色。光镜下每张载片计数200个细胞并计算阳性率。

2 结果

2.1 巨噬细胞形态观察 东方田鼠腹腔巨噬细胞培养明场观察可见细胞核明显，胞质较丰富，活跃时内含有颗粒或空泡。具有变形运动和吞噬能力，细胞形状不一，外周多突起及伪足（图1）。HE染色后可见细胞呈圆形、椭圆形、三角形或不规则形，有伪足和突起，界限清楚。核大为卵圆形、肾形、马蹄型或不规则形，偏居于细胞的一端，着色较深（图2）。东方田鼠腹腔巨噬细胞和KM鼠在外观形态上相似。

图1 巨噬细胞明场下观察Fig.1 Macrophage observation under bright field

图2 巨噬细胞的HE染色观察Fig.2 HE staining of macrophages

2.2 巨噬细胞的吞噬功能 将分离培养腹腔巨噬细胞加印度墨汁培养3 h后可见其吞噬功能被激活，培养细胞的胞质及伪足和突起均有密集的墨汁颗粒，吞噬率为98%，显示东方田鼠具有较强的吞噬功能。同样处理的KM小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬也较强，两者无明显差异（图3）。

图3 巨噬细胞的墨汁吞噬试验Fig.3 Ink Phagocytosis test of macrophages

2.3 巨噬细胞的酸性磷酸酶表达 将培养5 d的巨噬细胞制备细胞爬片，酸性磷酸酶染色后可见东方田鼠巨噬细胞的胞浆内有大量的棕黑色颗粒，阳性率为98%；KM小鼠巨噬细胞胞浆的着色程度和东方田鼠类似（图4）。

图4 ACP染色观察巨噬细胞的酸性磷酸酶表达Fig.4 ACP staining to observe the expression of acid phosphatase in macrophages

2.4 巨噬细胞的非特异性酯酶表达 细胞培养3 d后经α-醋酸奈酚酯酶染色显示，大部分细胞的胞质呈蓝色，为强阳性细胞，少部分细胞的胞质呈略浅的红棕色，东方田鼠巨噬细胞阳性率为98%，染色后KM鼠的巨噬细胞非特异性酯酶的表达和东方田鼠相似（图5）。

图5 α-ANE染色观察巨噬细胞的非特异性酯酶表达Fig.5 α-ANE staining to observe non-specific esterase expression in macrophages

3 讨论

东方田鼠是我国唯一对日本血吸虫病具有天然抗性的哺乳动物。东方田鼠体中的日本血吸虫先后移行经过皮肤、肺脏和肝脏等器官，最终在肝脏中消亡[7]。东方田鼠抗日本血吸虫病机制可能涉及多种因素，但无疑免疫机制是令人关注的。一些研究结果表明东方田鼠的抗性可能与其补体活性相关[7-9]，也有报告观察了东方田鼠血细胞在其感染过程中的表现[10-11]。孙军等[12]应用基因表达谱研究的结果表明，感染后东方田鼠肺肝组织中非特异性免疫和特异性免疫相关基因表达活跃。Jiang等[13]进一步研究表明东方田鼠感染后与免疫相关的基因表达上调，其中包括补体和Fc受体等。Hu等[14]应用RNAseq分析显示大量与免疫相关的基因差异表达与感染相关，推测固有免疫与适应性免疫反应在杀伤血吸虫过程中起重要作用。Han等[15]研究结果表明东方田鼠感染后表达差异的miRNAs主要与免疫调节和营养代谢相关。

天然免疫细胞在先天免疫反应中起到重要作用并且还可以通过分泌细胞因子来调节适应性免疫反应[16]。巨噬细胞是重要的天然免疫细胞，对血吸虫具有杀伤作用[5]。王庆林等[11]观察到感染日本血吸虫后3～16 d，东方田鼠血液嗜酸性粒细胞具有趋化性和粗大的嗜酸性颗粒，其中含有过氧化物酶和酸性磷酸酶，可以有效杀死寄生虫。刘金明等[17]在体外培养中观察到东方田鼠巨噬细胞能黏附在日本血吸虫童虫表面，但所用的巨噬细胞是经石蜡油刺激后获得，获得量大但功能特性上可能与原始巨噬细胞差异较大。本文在此基础上进行改进应用快速振荡法分离腹腔巨噬细胞，简单易行，数量足够后续实验用，在形态上与其它物种并无差异。HE染色和墨汁吞噬试验结果表明，细胞纯度和均一性较好，细胞的吞噬活性很高。酸性磷酸酶和特异性酯酶是溶酶体酶，是巨噬细胞执行其生物学功能的重要分子，也是巨噬细胞的标志酶。本研究结果显示，东方田鼠腹腔巨噬细胞的酸性磷酸酶和非特异性酯酶的表达和KM鼠类似，但其对血吸虫是否有杀伤效应和在抗性机制中的作用有待于进一步研究。

本文应用振荡法分离培养东方田鼠腹腔巨噬细胞，操作简便，细胞形态、吞噬活性和酶活性等较好，为研究巨噬细胞在东方田鼠抗性机制中的作用提供了基础。