一株流产猪胎来源的GI JEV 的分离、鉴定与分子特征

郭 爽，王 欣,2，庞琳琳，张俊杰，李宗杰，李蓓蓓，刘 珂，邵东华，邱亚峰，马志永，魏建超

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.长江大学，荆州 434000）

流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE）是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）引起的一种自然疫源性人兽共患病，多在夏秋季节流行，吸血蚊虫是其主要的传播媒介，猪是主要的扩增宿主。该病可导致妊娠母猪流产，胎儿多为死胎或木乃伊胎[1]。引起公猪睾丸炎，常有一侧或两侧睾丸肿胀，给养猪业造成了巨大经济损失[2]。该病可通过蚊虫叮咬传染给人，引起脑炎，造成中枢神经系统疾病，给公共安全带来威胁。

JEV属于黄病毒科、黄病毒属成员，是一种有囊膜的单链正义RNA病毒，全长约11 kb，共编码3个结构蛋白与7个非结构蛋白，依次为5'UTR-CPrM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3'UTR[3]。其中E蛋白是病毒颗粒表面最重要的成分之一，与病毒嗜性和毒力密切相关，对产生中和抗体中发挥重要作用[4]。JEV有1种血清型，基于E蛋白基因的核苷酸序列，可将其分为5种基因型（GIGⅤ型）[5]。2001年之前GⅢ JEV是的主要基因型，近年来分离到GI JEV概率显著增加，在在辽宁省、四川省、河南省、山东省、贵州省和上海市等地被频繁检测到[6]。研究表明，我国JEV的优势基因型正在发生转变，GI/III JEV的共同流行正变得普遍，GI JEV已经取代了GIII JEV，成为许多地区的主要基因型[7-8]。

本研究对2015年采集自上海市奉贤区猪场的疑似感染JEV的猪病料样品进行检测，从流产胎儿脑组织中成功分离得到1株JEV，命名为SD12株（GenBank登录号：MH753127）。为了解该分离株的生物学特征和分子进化情况，对其全基因构建遗传进化树，为上海地区猪JEV的防控与疫苗研发奠定了坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 乳仓鼠肾细胞BHK-21和弱毒株SA14-14-2由本实验室保存。Trizol Reagent购自Invitrogen公司；QIAamp®Virus RNA Mini Kit购自QIAQEN公司；PrimeScript RT Master Mix购自Takara公司；DNA marker购自宝生物工程（大连）有限公司；10%中性福尔马林固定液购自北京索莱宝科技有限公司；Q5®High-Fidelity DNA Polymerase购自NEB（北京）有限公司；鼠源抗JEV NS3蛋白多克隆抗体由本实验室制备保存，荧光素标记兔抗鼠抗体（FITC-IgG）购自Sigma公司；C57BL/6小鼠购自上海捷斯捷实验动物有限公司。

1.2 引物设计 鉴于我国目前是GI/GⅢ JEV共同流行趋势，合成检测GI/GⅢ JEVE基因的通用检测引物JE-F/R[9]，设计分段扩增引物F1-F8，均由派森诺生物科技有限公司合成（表1）。

表1 本研究使用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 病料的处理与病毒的分离培养 采集的样品经研磨后反复冻融，取200 μL研磨液用TRIZol提取组织RNA，用于RT-PCR检测。PCR检测阳性样品的剩余研磨液使用0.22 um无菌滤膜过滤后，接种于BHK-21细胞盲传3代，同时设毒株SA14-14-2对照组和正常细胞对照组。观察细胞的生长状态，若出现细胞病变达约70%时收获细胞上清液冻存备用。利用QIAamp® Virus RNA Mini Kit，按说明书操作提取病变细胞总RNA用于RT-PCR分段扩增病毒基因。

1.4 RT-PCR检测及全基因分段扩增 参照PrimeScript RT Master Mix说明书，获得cDNA。取2 μL cDNA为模板，加入上、下游引物各2.5 μL，0.5 μL Q5®High-Fidelity DNA Polymerase，ddH2O补足至50 μL，混匀后置于PCR仪中扩增。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，阳性产物送至派森诺生物科技有限公司测序。

1.5 间接免疫荧光鉴定 BHK-21细胞感染0.01 MOI病毒。24 h后细胞用冰冷的丙酮固定，分别孵育一抗和二抗。最后使用荧光显微镜检测阳性细胞[10]。

1.6 病毒噬斑和病毒滴度测定 将噬斑纯化后的毒株10倍梯度稀释，依次接种BHK-21单层细胞的96孔板，测定病毒滴度[11]，在6孔板进行噬斑测定，同时分别通过脑内和腹腔感染小鼠，每日观察细胞病变情况与小鼠发病及死亡情况，按Reed-Muench法计算LD50。感染致死小鼠和正常小鼠的脑组织用于制作病理组织切片，显微镜观察病理结果。

1.7 序列分析 在NCBI中下载JEV参考毒株的基因序列，使用MegAlign软件完成核苷酸相似性和氨基酸同源性分析，并使用MEGA绘制基于Neighborjoining（NJ）法的系统进化树。

2 结果

2.1 RT-PCR鉴定 分别以检测引物和分段引物扩增cDNA，结果显示目的片段大小与预期大小相符合（表1），表明检测样本中还有JEV的全部基因组，将扩增产物送派森诺生物科技有限公司测序（图1）。

图1 JEV SD12 PCR扩增结果Fig.1 The PCR results of JEV SD12 isolate

2.2 细胞病变的观察 纯化的病毒经连续传代，细胞病变时间稳定。与正常的BHK-21细胞相比较，接种SD12株的细胞在感染48 h左右开始出现圆缩并逐渐脱落，感染60 h大部分细胞漂浮并逐渐死亡，接种SA14-14-2株的细胞出现类似的病变情况（图2）。

图2 接种细胞观察（100×）Fig.2 Observation of inoculated cells (100×)

2.3 间接免疫荧光染色试验 感染SD12株的BHK-21细胞的胞浆呈现特异的绿色荧光信号，未接毒细胞没有荧光信号，由此可进一步鉴定SD12株为JEV阳性，细胞的病变是由JEV引起的（图3）。

图3 荧光染色结果（400×）Fig.3 Fluorescent staining results (400×)

2.4 病毒噬斑与病毒滴度 经BHK-21细胞噬斑测定，SD12株的病毒滴度为1.25×106PFU/100μL。按Reed-Muench法计算LD50，接毒C57BL/6小鼠12 h后开始出现离群、抽搐、震颤等症状，大多数小鼠在72 h内死亡。脑内感染小鼠的LD50为102.70PFU，经腹腔感染小鼠的LD50为102.70PFU，表明分离株具有较强的神经毒力。解剖对照组和死亡小鼠发现脑组织出现充血和水肿，观察脑组织病理切片可见神经元坏死，神经细胞周围间隙增宽，部分脑血管周围有较多淋巴细胞浸润（图4）。

图4 脑组织病理学观察（200×）Fig.4 Brain tissue pathological observation (200×)

2.5 序列分析 采用MegAlign将SD12株同NCBI种32株JEV毒株进行序列比对，结果显示，SD12株与HEN0701株的核苷酸同源性最高99.7%，氨基酸同源性99.8%，与SA14-14-2的核苷酸同源性88.6%，氨基酸同源性97.4%。此外，SD12同部分毒株E蛋白氨基酸相比较差异如表2所示。

表2 分离株E蛋白氨基酸序列位点与其他毒株的差异Table2 Comparison of the E protein amino acid sites of isolate with other strains

2.6 进化树分析 参考Chen等[12]建立的JEV基因分型方法，构建系统进化树，33株病毒被分成5大簇，分离株SD12与HEN0701在进化树上形成一个小分支，并且与Ishikawa和Mie这些经典基因I型毒株位于同一大簇中，根据基因分型方法，可判定分离株SD12属于GI JEV（图5）。

图5 JEV基因遗传进化树Fig.5 Phylogenetic tree based on JEV gene

3 讨论

2001年首次从上海猪场采集的蚊虫中分离到多株GI JEV[13]。2003年孙泉云等[14]调查发现崇明、奉贤和闵行三区的母猪阳性率为5.55%～40%。2010年张丽颖[15]在上海猪群检测到JEV抗体的阳性率高达68.69%，但无法区分是由疫苗或野毒感染导致。研究主要集中在检测血清阳性率，没有从上海猪体内分离株的相关报道。近年来，生猪集约化养殖加快，导致猪群感染JEV的概率增加，但同时猪群和人群的预防接种等综合防控措施的施行，全国乙脑发病率呈下降趋势[16]。

JEV E蛋白是重要的结构蛋白[17]，由三个结构域构成，结构域I中有糖基化位点与具有血清学及生物活性的抗原表位；结构域Ⅱ中含有中和表位和具有血凝活性的抗原表位；结构域Ⅲ在含有形成免疫球蛋白样结构，被认为与形成受体结合位点有关[18]。SD12株与SA14-14-2株E蛋白共有14个氨基酸差异，其中E138、E176、E177位于结构域I，E107、E129、E222、E244、E264和E279位于结构域Ⅱ，E315、E327和E366位于结构域Ⅲ，E439和E447位于结构域之外。Yang等[19]通过反向遗传证明E107和E138位决定JEV神经毒力，E138位更加关键，E176/177位突变显著中和E107和E138位的功能，E279突变会影响病毒噬斑大小。Zheng等[20]通过反向遗传进一步证明E138位点酸碱性决定JEV神经毒力。SD12株E138位为酸性氨基酸谷氨酸，表明SD12株具有强毒特征。Wu等[21]研究的三个中和表位（E337～E345、E377～E382、E397～E403）在SD12种没发生变化，氨基酸的同源性较高（97.2%），理论上当前我国使用的疫苗能够预防该毒株的感染。但SA14-14-2株为我国70年前分离的毒株与新流行的毒株属不同的基因型，E基因核苷酸差异较明显（87.5%），且不同毒株之间的毒力差异大，因此需要评价SA14-14-2株对新流行毒株的中和能力。Ye等[22]通过反向遗传证明A222S和S327T突变不改变病毒复制，但会降低SA14-14-2疫苗株诱导中和抗体水平，说明E222和E327是潜在的基因型相关中和决定簇，突变SA14-14-2的这两个位点可增加其对GI JEV的中和抗体水平，SD12株存在上述位点差异，推测致弱SD12株能够诱导产生更高水平的中和抗体。Wei等[23]通过交叉保护实验验证，SA14-14-2疫苗株对GI JEV感染的小鼠不能提供完全保护，暗示有进一步研发GI JEV疫苗的必要。

本研究首次在上海猪群中分离到1株GI JEV，命名为SD12，上传基因组序列至NCBI（GenBank登录号：MH753127）。表明上海猪群中存在GI JEV流行，通过分析氨基酸差异发现本毒株关键毒力位点突变后能够成为GI疫苗候选株，为猪JEV的防控与疫苗研发奠定了坚实的基础。