攀西地区牛肠道病毒遗传变异分析

杨佳欣，张 涛，淦雨洁，许 佳，王思芦，郝桂英，徐 睿，邓 宇

（1.西昌学院动物科学学院，西昌 615000；2.凉山州畜科所，西昌 615000）

肠道病毒（Enterovirus，EV）能广泛地感染牛、羊、猪、鸡等家畜家禽及人类。肠道病毒属共包括15个种，12个肠道病毒种（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L），3个鼻病毒种（A、B、C）[1]。牛肠道病毒（Bovine enterovirus，BEV）属于小RNA病毒科肠道病毒属，包含E种肠道病毒和F种肠道病毒，是不含囊膜结构的单股正链RNA病毒，其中E种可划分为E1-E4基因亚型，F种可划分为F1-F6 基因亚型[2-3]。BEV基因组全长7.3-7.5kb，包含一个5' 非编码区（5' untranslated region，5'UTR），一个开放阅读框（open reading frame，ORF），3' 非编码区（3' untranslated region，3'UTR），3'UTR的末端含有一个长度有差异的多聚腺苷酸尾巴（poly-A），BEV的ORF可以直接作为mRNA翻译出一个多聚蛋白，经裂解，最终可以得到4种结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7种非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）[4-6]。BEV在污水、粪便中可存活4～6个月，环境温度越低存活时间越长，在pH3.0的酸性环境中能保持自身活性，对一些常见的消毒剂如70%乙醇和5%甲酚溶液具有耐受力。但BEV对碱性环境和热敏感，在pH10.0以上、高温（50℃以上）和紫外线照射等条件下处理30 min会失去生物活性[7-9]。

攀西地区位于四川省西南部安宁河平原，辖凉山彝族自治州、攀枝花市等20个县、市，属于典型的高原型内陆山区，以农牧业经济发展为主，近年来该地区农业生产结构在不断调整，畜牧业产值占比持续上升，畜牧业生产中以奶牛和黑山羊养殖为主[10]。BEV呈世界范围流行，在攀西地区迄今尚未见BEV感染报道，本研究通过对牛粪便样本进行RT-PCR检测及遗传进化分析，初步揭示攀西地区BEV流行情况，为BEV的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 引物合成 根据GenBank中BEV 5'UTR序列，参考文献[11]，合成1对引物，上游引物BEV-TUP-F：5'-GGGGAGTAGTCCGACTCCGC-3'，下游引物BEV-TDN-R：5'-CRGAGCTACCACYGGGDW TGTGG-3'，预期扩增片段大小272 bp。

1.2 样品的采集及处理 采集攀西地区牛新鲜粪样本共93份，分别标记暂存于冰盒内，存于-20℃备用。将新鲜牛粪样品与生理盐水按质量与体积（W/V）1∶3稀，释充分震荡混匀，部分呈液状的粪便样本按体积之比1∶3，用生理盐水进行稀释混匀。反复冻融3次，8500×g离心10 min，收集上清液，分别用0.22 μm微孔 PVDF滤膜过滤除菌，过滤后的样本-80℃长期保存。

1.3 主要仪器试剂 主要仪器：5804R低温差速离心机购自德国艾本德公司（Eppendorf），漩涡式混合器VORTEX-5，Eppendorf PCR仪，琼脂糖凝胶电泳仪，BIO-RAD 凝胶成像系统，蓝光切胶仪，-80℃超低温冰箱。主要试剂：反转录试剂盒AccuPower®RocketScriptTM RT PreMix购于BIONEER公司。UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、2×TaqPCR Master Mix、5×TBE buffer缓冲溶液、4S Green Plus无毒核酸染料、DNA分子量标准marker、琼脂糖凝胶购自上海生工公司。

1.4 RT-PCR扩增 将处理后的粪便样本上清分别用Trizol UNIQ-10柱式总RNA试剂提取试剂盒参照说明书提取样本中的总RNA。采用反转录试剂盒以下游引物（BEV-TDN-R)作为反转录引物将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板，进行PCR扩增，其扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40次循环；72℃再延伸10 min。

1.5 琼脂糖凝胶电泳 用TBE缓冲液与琼脂糖制备浓度为1%琼脂糖凝胶，往胶孔中分别加入PCR扩增产物（6 μL）与marker（8 μL），105 mV电泳30～35 min，凝胶成像。

1.6 PCR产物回收 用干净的手术刀片快速将疑似目的片段切割分离至1.5 mL离心管中，并称重，切胶时要尽量去除不含有目标片段的琼脂糖凝胶。根据SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行DNA回收。

1.7 克隆测序 用T4 DNA连接酶将回收的DNA片段连接到T载体上，16℃过夜连接。将目的片段通过热击转化到大肠杆菌中，37℃培养45 min，取菌液涂布于LB氨苄平板上，并加X-gal和IPTG，将平板于37℃培养16 h，进行蓝白斑筛选试验，挑白色克隆菌群于LB液体培养基（含氨苄）中培养12 h，应用PCR检验菌液是否含有目的片段，将阳性质粒送至上海杰李生物科技有限公司测序。

1.8 遗传进化分析 应用 Lasergene DNA Star和MEGA-X软件将样本序列与国内外其他地区 BEV 代表性毒株5'UTR序列进行同源性分析，绘制遗传进化树。

2 结果

2.1 RT-PCR检测结果 运用RT-PCR方法对攀西地区采集的93份粪便样本进行检测，1%琼脂糖凝胶电泳成像，见图1。结果显示：攀西地区采集的93份牛粪便样本中，13份样本呈BEV阳性，感染率13.98%。

图1 样品 PCR扩增结果Fig.1 PCR-amplified BEV 5'UTR from samples

2.2 同源性分析 将测定的样本序列与 GenBank上国内外已发表的BEV基因序列，采用Cluster W算法进行多序列比对，运用Lasergene DNA Star进行同源性分析，见表1。结果显示：攀西地区牛场同一奶牛场存在 E种和F种BEV感染；攀西地区BEV分离株PX-161、PX-162、PX-163、PX-164与E种BEV代表病毒株具有较高的同源性，其中与国内代表株HY12[7]同源性最高，其同源性为88.4%。

表1 攀西地区BEV分离株与国内外BEV代表株同源性分析Table1 Homology analysis of BEV isolates in Panxi region with the representative BEV strains in China and abroad

攀西地区BEV分离株PX206、PX8311、PX8312、PX8313、PX8306、PX8307、PX8308、PX8268、PX8269与 F种EV代表株具有较高的同源性，部分毒株与国内代表株BEV-HeN-YR91株[5]同源性最高，其同源性高达96.3%～96.6%。PX8268、PX8269与国内代表株BJ001[18]株同源性最高达83.9%。攀西地区BEV分离株之间的同源性为75.5%～99.8%。

2.3 遗传进化树的构建 运用MEGA-X软件将比对后的序列采用邻接法（Neighbor-Joining）构建遗传进化树，见图2。结果显示：分离株PX161、PX162、PX163、PX164与HY12[18]同属一个分支，初步判断这些分离株属于E种EV。分离株PX206、PX8311、PX8312、PX8313、PX8306、PX8307、PX8308 与参考株BEV-HeN-YR91同属一个分支，初步判定这些分离株为F种EV。PX8268、PX8269与BJ001[7]毒株分支长度接近，同属一个分支，初步判定为F种EV，统计分析发现，在攀西地区同一奶牛场内存在E种和F种EV感染。

图2 攀西地区BEV分离株与国内外BEV代表株遗传进化树Fig2.Genetic evolution tree of BEV isolates in Panxi area and representative BEV strains at home and abroad

3 讨论

BEV 5'UTR是一段相对比较保守稳定的基因序列，与其他种的肠道病毒5'UTR相比,在三叶草结构与核糖体结合位点之间多了一个100个核苷酸左右的二级RNA结构，常以此区域的特异性对不同种的肠道病毒进行分子学鉴定[11-12]。同时有研究表明BEV 5'UTR、病毒衣壳蛋白VP1-VP4 与3D非结构蛋白核苷酸序列的差异，是BEV分型的重要参考依据[13]。BEV5'UTR中通过折叠形成的特异的空间结构能与宿主细胞中一些蛋白子因子特异性结合，对病毒的复制翻译转录过程产生调控作用[14-15]，影响BEV的毒力及易感动物的范围。

Moll等[16]首次发表了BEV感染的相关报道，李英利等[17]在内蒙古腹泻犊牛体内分离到我国第1 株F种BEV。2012年邢泽黎等[7]从吉林长春某发病牛群中首次在我国牛群中分离出E种EV HY12毒株与本研究所分离的E种EV同源性高达88.4%。彭小薇等[18]在北京分离出的BJ001与本次分离的PX8268、PX8269同属F种，有较高的同源性达88.4%，2018年钱明珠[5]在河南省分离了两株F种EV毒株，其中BEVHeN-YR2毒株与攀西地区分离的F种毒株的同源性高达96.3%～96.6%。这些报道表明BEV在我国多个省市的牛群中存在着普遍感染现象，报道中不同的省市地区多呈现BEV单种感染，但在本研究中，攀西地区BEV感染率13.98%，存在E种和F种EV感染，其中以F种EV感染为主。

目前关于BEV的致病性还存在部分争议，致病机制也尚未明确。部分学者认为BEV和其他的小RNA肠道病毒属的病毒一样，是导致宿主诱发消化道和呼吸道疾病的相关病原体，牛群在感染BEV后可引起食欲减退，下痢和呼吸道症状，严重的还会出现便血、产奶量大幅度降低等临床症状[4]，有的学者认为BEV的致病机制主要是诱导宿主体内产生了大量有害的炎症因子，对机体的生理功能造成损害[19]。但之前也有部分报道称BEV广泛存在于自然界中，是牛肠道中原有的栖居者，在牛的肠道中增殖，致病性不明显，常呈隐性感染或只引起轻度腹泻。本研究中BEV阳性牛无明显临床症状。但BEV感染在我国还属于新发传染病，其致病性有待后续进一步研究。