一种快速简便的伪狂犬病病毒EP0基因RT-qPCR检测方法的构建

张丽荣，阮可悦，童 武，李国新，高 飞，单同领，于 海，童光志，郑 浩

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

伪狂犬病（Pseudorabies, PR)，又称Aujeszky's病，是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起猪、牛、羊等多种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）以及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病[1]。猪是该病的主要传染源以及自然贮存宿主[2]。猪感染伪狂犬病后常引起初生仔猪发病，死亡率100%[3]；育肥猪生长缓慢甚至成为僵猪；种猪丧失种用价值；妊娠母猪流产、产死胎或木乃伊胎[4-5]。与其他疱疹病毒一样，伪狂病病毒具有长期潜伏感染、终生带毒的特征。

PRV的增殖是遵循严格的时序方式进行的。Ben-Porat等根据PRV DNA转录和表达时间的先后顺序将基因分为立即早期基因（immediate early gene,IE)，早期基因（early gene, E）和晚期基因（late gene, L)，并以级联方式进行调控[6]。PRV只有一个立即早期基因，即IE180[7]。早期基因有EP0基因、TK基因以及UL54基因。其中EP0基因位于UL区，其转录方向与潜伏相关转录体（large latency transcripts,LLT）方向相反，与立即早期基因IE180彼此相邻且转录方向一致。由于EP0基因与反转录的LLT大部分重叠，缺失LLT基因的同时难以避免缺失一部分的EP0序列，从而影响EP0的表达[8]。

EP0转录的mRNA约为1.75 kb，分子量为45 kDa左右，可编码1230个核苷酸（编码410个氨基酸）的开放阅读框[9]。EP0基因是PRV的早期基因，而与之相对应HSV-1的ICP0早期基因则为极早期基因，但EP0具有ICP0蛋白相应功能。ICP0蛋白分子是HSV-1病毒极早期基因、早期基因以及晚期基因的反式激活因子，其锌指结构为反式激活动能所必需。有研究表明：EP0基因对于PRV的复制是非必需的，但是EP0作为病毒基因启动子的反式激活物，对于潜伏感染的激活是必要的[10-11]。在体外培养的细胞中，EP0可以激活基于TATA框启动子的转录起始[12]。在体内，EP0可以激活多种PRV编码基因的启动子，如IE180、UL23（胸苷激酶）和US4（gG）等[13]。

实时荧光定量PCR技术已经广泛应用于很多病毒的检测，不仅可以对检测的序列进行定性分析，而且可以对其进行准确定量，与常规PCR技术相比具有更高的敏感性、特异性和更好的重复性，以及快速和污染几率低等优点[14]。本实验室采用SYBR GreenI建立了一种PRV EP0基因的实时荧光定量检测方法，以期为EP0基因的定量分析提供一种简便快速、经济和灵敏的检测方法，同时也为PRV潜伏感染时病毒表达的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒 伪狂犬病病毒变异株JS-2012株为实验室分离鉴定并保存[15]。LLT单个启动子缺失病毒JSL1R1[16]、双启动子缺失病毒JS-L1R3和JS-UL1R3均由本实验构建和保存。

1.2 主要试剂 反转录试剂盒、PBS磷酸盐缓冲液、TRIzol试剂均购自中国赛默飞世尔公司；荧光定量PCR所用试剂购自TaKaRa公司；细胞培养基DMEM购自上海西格玛奥德里奇公司；培养细胞所用FBS胎牛血清、消化胰酶0.25%Trypsin-EDTA（1×）购自Invitrogen（美国）。

1.3 接毒以及RNA的提取 将接种用细胞均匀的铺在6孔板中，待细胞长至90%以上时接毒。按照1 MOI的剂量接种细胞，放置细胞培养箱（37℃、5%CO2）中吸附1 h后弃掉病毒液，换成含2%的FBS培养基继续放置细胞培养箱中培养。在接毒8 h后按照TRIzol总RNA提取液说明书提取样品的总RNA。

1.4 DNaseI消化 按照DNaseI消化试剂盒使用说明书进行操作，消化体系为25 μL：总DNA模板为21.5 μL，DNaseI消化酶1 μL，10× DNaseIReaction buffer 2.5 μL，轻轻混匀后放置37℃水浴30 min，加入0.25 μL的0.5 mol/L的EDTA，75℃水浴10 min以终止反应。

1.5 反转录过程 按照反转录试剂盒说明书进行操作，反转录总体系为20 μL：RNA模板8 μL，Random primer（0.1 μg/μL）1 μL，RNase-free water 3 μL，轻轻混匀后放置65℃水浴5 min，立即放冰上备用。然后加入5× Reaction buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，Ribolock RNase Inhibitor（20 U/μL）1 μL，Revert Aid M-MuL VRT（200 U/μL）1 μL，轻轻混匀后先放置25℃条件下反应5 min，之后45℃条件下反应60min，最后放置70℃条件下终止反应5 min。

1.6 RT-qPCR方法的构建以及优化 根据本实验室获得的两种不同剪接方式的EP0基因序列对比结果分析，采用Primer Premier 5.0软件设计荧光定量检测引物，EP0334-F：5-GGAAGAGGATGAG CCGGTCT-3；EP0442-R：5-GGTTCATCCCGTG CTCCTG-3。荧光定量反应体系为：2× SYBR Green PremixEx TaqTM10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA为2 μL，最后用RNase-Free water 补足至20 μL。设计3个退火温度（分别为55℃、60℃和65℃），选择反应信号强度最高，Ct值最小的退火温度作为最适反应条件。

1.7 病毒基因组对RT-qPCR方法的影响 提取病毒的RNA后，将所得样品分为两份处理，一份利用DNaseI消化处理，一份不使用DNaseI消化，检测DNaseI消化前后的RNA中EP0基因是否表达。

1.8 不同反转录引物对RT-qPCR方法的影响 分别选择反转录试剂盒中的Random Primer和Oligo（dT）对所提取的RNA进行反转录，检测不同反转录引物对EP0基因表达量的影响。

1.9 EP0基因的时态表达特征 根据JS-2012的病毒滴度按照1 MOI的剂量接种细胞，分别在2、4、8、12 h和16 h收取病毒RNA，检测EP0基因的动态表达特征。

1.10 RT-qPCR方法的初步临床应用 将JS-2012野毒株和LLT启动子缺失突变病毒按照104TCID50的剂量滴鼻接种小鼠，观察小鼠发病情况和死亡情况，并利用构建好的RT-qPCR方法检测小鼠三叉神经组织中EP0的表达量。

2 结果

2.1 荧光定量RT-qPCR构建及优化 试验结果显示：60℃退火温度条件下可获得良好的扩增效果。在这个反应条件下反应信号强度最高，Ct值最小（图1），并且溶解曲线单一、重复性较好（图2）。所以本RT-qPCR方法的最适反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，共40个循环。反应体系为：2×SYBR Green PremixEx TaqTM10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 2 μL，用RNase-Free water补足至20 μL。

图1 RT-qPCR扩增曲线Fig.1 Amplification curve of RT-qPCR

图2 RT-qPCR溶解曲线Fig.2 Melting curves of RT-qPCR

2.2 病毒基因组对RT-qPCR方法的影响 为了避免病毒基因组对反转录的影响，本研究利用DNaseI将提取的RNA进行消化。结果显示：将DNaseI处理前后的RNA分别作为模板进行qPCR，结果显示DNaseI消化前后，均检测不到EP0的转录。PRV基因组DNA为模板，也检测不到EP0的转录。但是DNaseI消化前后的RNA作为模板进行反转录得到的cDNA作为模板进行qPCR，结果显示在DNaseI消化前后均能检测到EP0的表达，并且差异不显著。这表明，病毒基因组DNA的存在与否并不影响该RT-qPCR方法的检测结果（图3）。

图3 病毒基因组对RT-qPCR的影响Fig.3 The effect of the viral genome on RT-qPCR

2.3 不同反转录引物对RT-qPCR方法的影响 为了提高反转录效率，本研究利用反转录试剂盒中提供的两种引物Random primer和Oligo（dT）分别对总RNA进行反转录，比较两种引物的反转录效率，RT-qPCR结果显示：利用Random Primer反转录，EP0的表达量显著高于Oligo（dT）反转录表达量（P＜0.0001），差异极显著，具有统计学意义（图4）。

图4 不同引物对比结果Fig.4 Comparison results of different primers

2.4EP0基因的时态表达特征 将亲本病毒按照1 MOI的剂量接种6孔板，利用TRIzol试剂收取不同时间点的细胞总RNA，利用本研究建立的RT-qPCR方法检测细胞中的EP0的动态表达情况。结果显示：病毒感染后2 h，EP0开始表达，这表明EP0是一种早期基因；在8 h后EP0基因的表达量达到最高，之后随着时间的延长逐渐减少（图5）。

图5 EP0基因的时态表达特征Fig.5 Temporal expression characteristics of EP0 gene

2.5 RT-qPCR的临床初步应用 按照104TCID50的剂量滴鼻接种小鼠，结果发现突变病毒也能造成小鼠发病并死亡。在攻毒后的第3 d小鼠开始发病，出现典型的伪狂犬病临床神经症状：部分小鼠表现为异常兴奋，头部瘙痒，频繁抓挠头部皮肤导致头部抓破；部分小鼠表现为精神沉郁、畏寒，肢体蜷缩在一起，食欲减退，但最终所有小鼠均发病死亡。然后在小鼠死亡后立即取三叉神经并提取RNA反转录，利用建立好的荧光定量PCR方法对不同病毒感染的小鼠三叉神经组织进行检测。结果显示：该方法可以检测到三叉神经组织中EP0基因的表达。LLT启动子缺失突变病毒也可以表达EP0，但是与亲本病毒JS-2012相比，突变病毒中EP0的表达量大大降低。比较单个启动子缺失病毒JS-L1R1与双启动子缺失病毒JS-L1R3的表达量差异极显著（P＜0.0001），这表明第二个启动子缺失后可以影响EP0的表达。比较JS-L1R3和JS-UL1R3，结果显示JS-UL1R3的表达量较少（P＜0.05），这表明启动子前重复序列的缺失也会影响EP0的表达（图6）。

图6 小鼠三叉神经中EP0基因的表达水平Fig.6 Expression level of EP0 gene in trigeminal nerve of mice

3 结论

利用分子手段检测生物标志物已经成为了一种趋势，并且随着PCR技术的发展，更加精密、灵敏、高通量的PCR检测方法被开发并应用于临床监测。如数字PCR、seninest-PCR、多重荧光定量PCR等。对于含量极低、容易溶解、在蛋白水平检测时受基质影响较大，以及其他不能在蛋白水平检测的生物标志物，均可以尝试在核酸水平对其检测。

近来，我们检测到的EP0基因ORF中存在一内含子（231～368 nt），本研究根据EP0基因剪接后的序列成功建立了伪狂犬病病毒EP0基因的SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测方法。由于提出的PRV感染细胞总RNA中存在病毒基因组DNA，分析病毒基因转录水平时，常需要DNaseI消化去除PRV DNA的残留，以获得准确的实验结果。本文建立的EP0基因定量检测方法，对PRV基因组DNA、PRV感染细胞总RNA及其DNaseI消化处理的RNA，检测结果均为阴性；但是利用引物反转录后，DNaseI消化前后的样品均能检测到EP0基因的表达，并且表达量差异不显著。这表明，PRV基因组的存在不干扰该方法的检测结果，在EP0转录时不需要DNaseI处理总RNA样品，简化了EP0转录检测的实验流程，提高了检测效率，也可节省部分成本。同时，通过比较利用随机引物和Oligo（dT）这两种引物的反转录，结果显示随机引物具有转录检测效果。我们也利用该方法检测了EP0基因在细胞中的时态表达特征，结果显示EP0基因在感染后2 h已存在转录，8 h时表达量最高，之后逐渐减少。这显示出EP0是一种早期基因。随着感染时间延长，EP0转录量出现下降，这可能与EP0具有自调控功能有关。郭洪[17]研究显示，EP0在转染的细胞中能抑制其自身启动子的活性，表现出对自身表达的负调控功能。将该方法应用于感染不同病毒株的小鼠实验中，结果显示在小鼠三叉神经组织中均能检测到EP0基因的表达，并且LAT启动子缺失后EP0的表达比亲本毒株出现显著下降。因此本研究构建的RT-qPCR检测方法可以很好的检测EP0基因的表达，并且方法简单快速，也为EP0基因的功能研究奠定基础。