奶山羊SERPINA14基因克隆、生物信息学及组织差异表达分析

刘文轩，岳子婷，潘 坛，陈 冲，范德成，李 聪*

(1. 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

作为最早被人类利用的动物奶，山羊奶因其营养全面、容易消化等特点越来越受到消费者青睐。西农萨能奶山羊具有遗传性稳定、体格雄壮、泌乳性能好、适应性强等特点，常作为改良国内奶山羊的父本。随着生活质量的不断提高，人们对山羊奶品质尤其是其中蛋白质含量的要求也不断提高。因此，为选育出乳品质优异的奶山羊，挖掘参与调控乳蛋白合成代谢的关键基因，进而解析蛋白质合成代谢的机制通过分子设计育种实现上述目标是有效策略。

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor, SERPIN)家族由Hunt等于1980年根据卵清蛋白和人抗凝血酶等蛋白的一级结构保守性提出。14(serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 14)是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的重要成员，主要在孕酮的作用下在牛、羊、猪等动物的子宫内膜分泌。与SERPIN家族中多数成员不同，SERPINA14未保留抗蛋白水解活性，且在不同物种中所表达的蛋白质功能各异。目前对14基因的研究主要集中在猪和绵羊上，在山羊上的研究十分有限。在绵羊体内SERPINA14主要起免疫调节作用，防止胎儿同种异体排斥反应等；在猪体内SERPINA14通过结合并稳定铁结合蛋白，参与由母体子宫向胎儿的铁的转运。

本试验室前期对6只极端高低乳蛋白率的奶山羊乳腺组织进行转录组测序，鉴定到14基因(log2Foldchange=-2.44，p-value=3.85E-03)是影响奶山羊乳蛋白合成的关键候选基因。绵羊SERPINA14蛋白可抑制与妊娠相关的糖蛋白、天冬氨酸蛋白酶同生长因子的结合。以上研究均表明14基因在奶畜乳蛋白合成中发挥潜在的重要作用。

本研究拟克隆西农萨能奶山羊14基因CDS序列并进行生物信息学分析，通过qPCR(Quantitative Real-time PCR)技术检测基因在不同组织和不同泌乳时期的表达水平，为深入探究14基因调控奶山羊乳蛋白合成与代谢的分子机制奠定前提基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

选择3岁龄健康西农萨能奶山羊一只，屠宰后采集其肝脏、脾脏、乳腺组织、肾脏、瘤胃、小肠等组织1.5 g左右；选择3只3岁龄健康西农萨能奶山羊，在其不同泌乳时期进行活体采集乳腺组织各0.5 g左右，使用DEPC水对组织漂洗进行简单处理(除去外层薄膜及残余血迹)，迅速置于液氮中保存，以用于组织总RNA提取。

1.2 主要试剂及材料

本研究中所用主要试剂与材料如表1所示。

表1 主要试剂与材料Table 1 Main reagents and materials

1.3 SERPINA14基因CDS区克隆

1.3.1 引物设计与合成 根据NCBI中山羊14基因序列(登录号：XM_013973196.2)，采用Primer Premier5.0软件设计克隆PCR引物(片段全长1 311 bp)。F-引物(5'-3')：CGGGGTACCATGTCCCACGGGAGAATGAA；R-引物(5'-3')：CCCAAGCTTCTACTCAACTTGGGGGTTGAG。上下游引物分别带有KpnⅠ和HindⅢ 酶切位点。

1.3.2 西农萨能奶山羊乳腺组织总RNA提取及反转录 取乳腺组织0.1 g充分研磨，向研磨液中加入1 mL Trizol试剂裂解细胞，按照试剂说明书提取总RNA，对提取的总RNA用30 μL RNase-free HO进行溶解，经浓度和纯度(OD/OD≈1.8)测定符合要求后，根据PrimeScript RT Reagent Kit使用说明书，对RNA反转录使其成为cDNA。

1.3.3 西农萨能奶山羊14基因克隆与测序 以cDNA为模板，进行PCR扩增以得到14基因。PCR反应体系为 (20 μL) ：0.2 μL的cDNA模板；F-引物、R-引物 (10 μmol/L) 各1 μL；10 μL 的Prime Star MAX(含聚合酶、dNTPs等)；7.8 μL 的ddHO。PCR扩增程序为：预变性(98 ℃，3 min)、变性(98 ℃，10 s)、退火(60 ℃，5 s)、延伸(72 ℃，10 s)，按上述程序进行34个循环，之后72 ℃延伸3 min；12 ℃终止反应。配置1%琼脂糖凝胶，电泳检测扩增产物长度，利用上海生工胶回收试剂盒纯化目的片段。构建pMD19T-SERPINA14克隆载体，连接PMD-19T载体(16 ℃，12 h)。连接体系：脱氧核糖核酸片段(胶回收产物) 7 μL，Solution Ⅰ 5 μL，PMD-19T载体0.5 μL。将克隆载体转化感受态细胞DH5α，经氨苄霉素 (Amp) 抗性筛选后挑取阳性菌落，对菌液进行PCR鉴定 (PCR反应体系和程序同上)，将扩增产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。

1.4 SERPINA14基因的生物信息学分析

如表2所示，采用生物信息学分析软件和数据库对14基因及其表达的蛋白进行生物信息学分析。

1.5 SERPINA14基因组织表达谱

基于对瘤胃、肝脏、脾脏、乳腺、小肠、肾等9种组织以及处于不同泌乳时期乳腺组织提取的总RNA，利用实时荧光定量PCR技术检测14基因的mRNA表达水平。qPCR反应体系(10 μL)为：SYBRPremix EX Taq(2×) 5 μL，模板cDNA (1 000 μg/μL) 0.8 μL，F-引物、R-引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ddHO 3.4 μL。qPCR反应条件为：预变性(95 ℃，30 s)、变性(95 ℃，10 s)、延伸(55 ℃，30 s)，循环45次。内参基因为UXT(F：TGTGGCCCTTGGATATGGTT；R: GGTTGTCGCTGAGCTCTGTG)，定量引物SERPINA14(片段全长221 bp)F：CTGCCTAATTTGGAGGCCCTG；R:TCAACTTGGGGGTTGAGGAC；SERPINA14的组织相对表达量用2法定量，用GraphPad Prism v7.0.4进行绘图。

表2 生物信息学分析所用软件及数据库Table 2 Software and databases used in bioinformatics analysis

1.6 数据分析

使用SPSS 17.0软件处理试验数据，进行One-way ANOVA显著性检验，试验结果均以平均值±标准差表示。当数值<0.05时，统计学差异显著；当数值<0.01时，统计学差异极显著。

2 结果与分析

2.1 奶山羊SERPINA14基因CDS序列克隆

利用乳腺组织提取的总RNA，经扩增获得目的基因SERPINA14片段为1311 bp (登录号：XM_013973196.2)，如图1所示。测序后进行NCBI Blast比对，确定其为14基因CDS区，碱基含量分别为： A=30.0%，T=23.2%，C=26.3%，G=20.5%。

图1 SERPINA14基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱M. marker DL2 000; 1为PCR产物Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of SERPINA14gene amplification productM. marker DL2 000; 1 is the PCR product

2.2 同源性比对

将各个物种14基因序列进行比对，发现西农萨能奶山羊14基因核苷酸序列与山羊()、绵羊()、牛()、狗()和马()的同源性分别为100.00%、98.55%、90.08%、70.33%和69.78%；由系统进化树分析(图2)可得，西农萨能奶山羊SERPINA14基因序列与山羊同源性最高，其次是绵羊，所构建的系统进化树可直观地显示不同物种间的分子水平差异。

图2 SERPINA14蛋白系统进化树Fig. 2 SERPINA14 protein phylogenetic tree

2.3 生物信息学分析

2.3.1 理化性质 西农萨能奶山羊SERPINA14蛋白质含有氨基酸436个(表3)，氨基酸分子量49.89 ku；理论等电点为9.25；总分子式为CHNOS。分析可知不稳定系数为37.05，属于稳定蛋白一类。其中Leu和Lys含量占比相对较高，分别占15.1%和10.6%。Trp和Tyr含量占比相对较低，均为0.2%。Asp+Glu(带负电残基总数)为45个；Arg+Lys(带正电残基总数)为 55个；推测SERPINA14为碱性蛋白质，总平均亲水性为-0.113，是一种亲水蛋白。

2.3.2 SERPINA14蛋白磷酸位点分析 如图3所示，西农萨能奶山羊SERPINA14蛋白共检测出30个磷酸化位点，其中14个Serine(丝氨酸)磷酸化位点，16个Threonine(苏氨酸)磷酸化位点。

表3 西农萨能奶山羊SERPINA14蛋白的氨基酸组成Table 3 Amino acids composition of SERPINA14 protein in Xinong Saanen dairy goats

图3 SERPINA14蛋白磷酸化位点图Fig. 3 Distribution of phosphorylation sites of SERPINA14 protein

2.3.3 SERPINA14蛋白的亚细胞定位、跨膜结构及结构域分析 根据SignalP 4.1 Server分析显示，SERPINA14蛋白没有信号肽存在(0.4260)。而通过TargetP 2.0 Server预测 SERPINA14 蛋白存在信号肽(0.6057)，且信号肽的剪切位点位于第32和33号氨基酸之间(0.9294)，表明该蛋白可能属于分泌型蛋白。SERPINA14蛋白主要分布于内质网(55.6%)、高尔基体(11.1%)、线粒体(11.1%)、细胞核(11.1%)、细胞外，包括细胞壁(11.1%)。通过TMHMM预测跨膜结构域得知SERPINA14 蛋白为具有2段跨膜螺旋的跨膜蛋白(图4)，smart结构域预测其有SERPIN域(图5)。

图4 西农萨能奶山羊SERPINA14蛋白跨膜区预测Fig. 4 Transmembrane region prediction of SERPINA1 protein in Xinong Saanen dairy goats

图5 西农萨能奶山羊SERPINA14蛋白smart结构域预测Fig. 5 Prediction of the smart domain of SERPINA14 protein in Xinong Saanen dairy goat

2.3.4 SERPINA14蛋白质二级结构、三级结构预测通过在线蛋白分析系统分析显示，西农萨能奶山羊SERPINA14蛋白质中，237个氨基酸形成α螺旋状聚合物，48个氨基酸形成延伸链，151个氨基酸形成无规则卷曲聚合物，三者氨基酸含量占比分别为54.36%、11.01%和34.63%。SERPINA14蛋白质的二级结构、三级结构分别如图6和图7所示。

图6 SERPINA14蛋白质二级结构预测图Fig. 6 Prediction of secondary structure of SERPINA14 protein

图7 SERPINA14蛋白质三级结构预测图Fig. 7 Prediction of tertiary structure of SERPINA14 protein

2.3.5 SERPINA14蛋白相互作用预测图 通过分析，得到SERPINA14蛋白相互作用预测图如图8所示，发现SERPINA14与SLC2A5、STC1、CTSL2、PAG4等10种蛋白存在互作关系。

图8 SERPINA14蛋白质相互作用预测图Fig. 8 Prediction diagram of SERPINA14 protein interaction

2.4 SERPINA14基因组织表达谱分析

组织表达谱分析可以更好的为14基因在奶山羊不同组织内的功能研究提供前提基础。如图9所示，14基因以肌肉为对照组，其在肾脏组织中表达量最高(<0.01)；其次是乳腺；在小肠和脾脏中表达含量较低。如图10所示，对14基因在不同泌乳时期乳腺组织表达谱分析发现，以空怀为对照组，14基因在干奶期的乳腺组织表达量最高(<0.01)，其次是盛期和后期。

图9 SERPINA14在不同组织中相对表达量**代表P<0.01，差异极显著。下同。Fig. 9 Relative expression of SERPINA14 in different tissues** represents P<0.01, the difference is highly significant.The same below.

图10 SERPINA14在不同泌乳时期乳腺组织的相对表达量Fig. 10 Relative expression of SERPINA14 inmammary gland tissue at different lactation stages

3 讨 论

14基因属于SERPIN超家族，但是其与该家族中大部分成员不同，其表达的蛋白功能因物种而异。研究表明,绵羊上SERPINA14蛋白是由腺上皮分泌产生的，而牛上是由妊娠子宫内膜分泌产生。本研究通过TargetP 2.0 Server预测西农萨能奶山羊SERPINA14蛋白存在信号肽，可能为分泌型蛋白，结合亚细胞定位的结果，其主要分布于内质网上(55.6%)，而内质网主要发挥着合成分泌型蛋白和多种膜蛋白的作用，且在分泌型细胞的内质网中十分发达，揭示了SERPINA14可能在蛋白合成中起重要作用。组织表达谱揭示14基因在乳腺中表达量高于除肾脏外的其他组织，不同泌乳时期14基因在乳腺组织的表达为在干奶期表达量最高，其次是泌乳盛期和后期，推测14基因可能在奶山羊处于干奶期的乳腺组织发挥重要作用，调控乳蛋白的合成与分泌。研究结果为进一步通过基因编辑技术，敲除、干扰、过表达该基因，在细胞水平验证其调控乳蛋白合成与分泌的机制奠定基础；以期应用于改善羊乳品质，提高奶山羊泌乳性能。

对蛋白相互作用预测发现SERPINA14蛋白与SLC2A5、STC1、CTSL2、PAG4等10种蛋白存在互作关系。SLC2A5蛋白(GLUT5)是糖酵解关键蛋白，是哺乳动物细胞中特有的果糖转运蛋白。糖酵解是哺乳动物体内最重要的生化过程之一，也是为机体供能的主要途径。研究表明，通过SLC2A5蛋白(GLUT5)调控糖酵解过程，进一步影响癌细胞的生命进程，可以辅助肺癌治疗。山羊泌乳阶段会消耗大量能量，SLC2A5蛋白(GLUT5)通过加速糖酵解过程，为泌乳生理阶段快速提供大量能量，以满足泌乳需要，同时与SERPINA14蛋白互作，促进乳蛋白的合成，增加羊奶中蛋白质的含量。也有研究表明，孕酮和雌激素合用会减少腺上皮中SERPINA14 mRNA的表达，而1基因的表达会抑制牛的黄体细胞和FSH、LH和hCG刺激的大鼠颗粒细胞合成孕酮进而抑制SERPINA14蛋白的合成。An等发现1基因的表达可影响PI3K-AKT-mTOR通路，此信号通路已成为医学上癌症研究的热点，因此预测STC1蛋白(斯钙素1)在抗肿瘤与抗癌方面也有重要作用，而多项研究也证明了上述结果。CTSL2(组织蛋白酶L2)蛋白在山羊上尚未有报道，而Del等研究发现，在肉鸡上2基因的表达与蛋白质的分解有关，这对于乳品质的改善是一种不利因素，因此，要利用好SERPINA14蛋白与CTSL2蛋白的互作关系，降低2基因的表达。Gomes等提出SERPIN超家族的成员SERPINB3可能与CTSL2共同进化的假说，从侧面进一步验证了SERPINA14蛋白与CTSL2蛋白存在互作关系。PAGs(妊娠相关糖蛋白)是偶蹄类动物胎儿胎盘滋养层细胞合成、分泌的一类糖蛋白，且具有免疫调节和维持妊娠的作用，PAG4作为其中的一员，同样具有此功能。基于蛋白互作预测结果，发现与SERPINA14蛋白有互作关系的蛋白均直接或间接具有影响蛋白质合成或降解的功能，揭示其可能通过间接作用参与蛋白质的合成与降解过程。此外，有研究表明SERPINA14蛋白参与机体免疫与妊娠。Ulbrich等对14基因在牛各个发情时期和着床前早孕子宫内膜中的表达进行了全面定量分析，揭示了其在牛妊娠期间发挥关键作用；在体外SERPINA14的存在降低了丝裂原刺激的淋巴细胞增殖，同时抑制了肿瘤细胞系的生长，这也与蛋白互作预测的结果相符合。

14基因在奶畜泌乳中发挥的作用尚未报道，萨能奶山羊是世界上公认主要生产羊奶的优秀品种之一，随着人们对羊奶制品需求量的增多及羊乳品质要求的提高，改善羊奶品质显得尤为重要。本研究分析了14基因的初步功能，为从分子育种角度提高羊奶中乳蛋白含量提供了潜在新方向，为阐明羊乳蛋白合成与代谢调控机制提供了理论基础。

4 结 论

本研究克隆得到西农萨能奶山羊14基因CDS序列1 311 bp(登录号：XM_013973196.2)，编码436个氨基酸，蛋白分子量为49.89 ku，为稳定的碱性蛋白质，为跨膜亲水蛋白，具有SERPIN结构域，与SLC2A5、STC1、CTSL2、PAG4等10个蛋白存在互作关系。14基因在肾脏和乳腺组织中高表达，在干奶期高表达。